NLR家族Pyrin域蛋白3炎症小体对糖尿病大鼠牙槽骨缺损愈合的作用及其机制研究

郑毅，赵彤

（1.天津医科大学口腔医院 牙体牙髓科，天津 300070；2.天津医科大学第二医院口腔科，天津 300021）

牙槽骨缺损是指上下颌骨边缘镶嵌牙根处因牙周炎、创伤或肿瘤等因素导致该处骨组织受损。牙槽骨受损严重时，牙周组织支持力量减弱，牙齿松动甚至脱落，因此牙槽骨缺损的修复对口腔疾病患者至关重要。临床上无机材料、复合材料和自体牙骨移植材料常被用来修复牙槽骨缺损[1]。廖武堂[2]研究结构显示，Bio-Oss 骨粉结合猪小肠黏膜下层也可促进牙槽骨组织的再生，有效修复牙槽骨缺损。但很多牙槽骨缺损患者同时合并糖尿病，在高糖环境下，骨代谢紊乱[3]，牙槽骨缺损难以愈合，因此糖尿病患者的牙槽骨缺损修复是口腔科面临的难点之一。目前，尚未有针对糖尿病患者牙槽骨缺损修复的有效方法。

NLR家族Pyrin域蛋白3（NOD-like receptor 3,NLRP3）在糖尿病病程中扮演着重要角色。既往研究显示，抑制NLRP3 炎症小体可以加速糖尿病模型小鼠足部溃疡伤口的愈合[4]，但目前暂未见研究报道NLRP3 炎症小体的活性与糖尿病大鼠牙槽骨缺损愈合的关系。因此本实验探究抑制NLRP3 炎症小体糖尿病大鼠牙槽骨缺损愈合情况，以期为临床寻找治疗方案提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物4 月龄健康SD 雄性大鼠30只，体重（220±20）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005，实验动物使用许可证号：SYXK（沪）2019-0003。适应性饲养3 d，正常饮食、饮水。

1.1.2 主要试剂链脲佐菌素（上海源叶生物科技有限公司），NLRP3、Caspase-1、白细胞介素1β（Interleukin,IL-1β）、β-actin 兔抗大鼠一抗、HPR 标记羊抗兔IgG 二抗（美国Abcam 公司），护骨因子（osteoprotegerin,OPG）酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）试剂盒、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）ELISA 试剂盒（上海瑞番生物科技有限公司），抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase,TARP）染色试剂盒（上海一研生物科技有限公司），Hifair®V nCov Multiplex One Step RT-qPCR Probe Kit试剂盒、Trieasy™Total RNA Extraction Reagent TRIeasy™总RNA 提取试剂盒（上海翌圣生物科技有限公司），NLRP3 炎症小体抑制剂（YQ128）、动物组织蛋白抽提试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司），高糖饲料（上海锐赛生物技术有限公司）。

1.1.3 主要仪器血糖仪BGM501（上海寰熙医疗器械有限公司），多样品组织研磨仪CEBO-24（上海测博生物科技发展中心），全自动酶标仪318C+（上海沛欧分析仪器有限公司），Qubit 荧光定量仪、SimpliAmp PCR 仪（美国赛默飞世尔科技有限公司），80i 显微镜（日本Nikon 公司），一体式凝胶成像系统WD-9413D、转印电泳仪DYCZ-40K（北京六一生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病模型大鼠的复制高糖饲料饲养4 周后，大鼠腹腔注射0.1 mmol/L 柠檬酸-柠檬酸钠稀释的链脲佐菌素60 mg/kg。72 h 后用一次性测血糖针刺破大鼠尾尖取血（测量前12 h 禁食），用血糖仪检测血糖，血糖≥16.7 mmol/L 为糖尿病模型复制成功[5]。

将复制成功的糖尿病模型大鼠用2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，仰卧固定在手术台上，分离口腔上颌两侧第一磨牙腭侧的牙龈与粘骨膜，用球钻缓慢由近中向远中磨除部分牙槽骨骨质，形成大小约2.0 mm×2.0 mm×1.0mm 的缺口，磨除的同时注意用生理盐水冲洗冷却，缝合牙龈。

<1)，且各件产品是否为不合格品相互独立．

1.2.2 实验分组及给药将30 只大鼠随机分为对照组、模型组、炎症小体抑制组，每组10 只。模型复制成功后，炎症小体抑制组大鼠立即尾静脉注射20 mg/kg NLRP3 抑制剂（YQ128），1 次/d，连续给药28 d。对照组和模型组大鼠尾静脉注射等体积生理盐水，1 次/d，连续注射28 d。

1.2.3 空腹血糖检测给药结束后大鼠禁食12 h，用一次性测血糖针刺大鼠尾部取血，血糖仪测量各组大鼠空腹血糖。

1.2.4 骨代谢指标检测测量血糖后，大鼠尾静脉采血，1 000 r/min 离心10 min，取上清液采用ELISA检测OPG 和ALP 含量，严格按照试剂盒说明书进行操作，用酶标仪读数，将光密度值代入标准曲线计算相应孔位浓度。

1.2.5 牙槽骨缺损区苏木精-伊红（hematoxylineosin,HE）染色及Lane-Sandhu 评分采血后，处死各组大鼠，取左侧上颌骨复制缺损处的骨组织于多聚甲醛中固定24 h，然后置于100 g/L 乙二胺四乙酸溶液中脱钙处理10周，每2 天换脱钙液1 次。脱钙后取出骨组织，常规脱水，石蜡包埋，蜡块切片约4 μm厚，进行HE 染色，显微镜下观察牙槽骨愈合情况。根据Lane-Sandhu 评分标准[6]评价再生情况，包括：①骨形成。无骨形成计0分，骨形成占骨缺损＞0%～25%计1分，骨形成占骨缺损＞25%～50%计2分，骨形成占骨缺损＞50%～75%计3分，骨形成占骨缺损＞75%～100%计4 分。②骨连接。骨折线清晰计0分，骨折线部分存在计1分，骨折线消失计2 分。③骨塑形。未见塑形计0分，髓腔形成计为2分，皮质骨形成计4 分。

1.2.6 TARP 染色观察破骨细胞数参照WU等[7]检测方法，取1.2.5 中石蜡切片，加入蒸馏水水化脱蜡，采用TARP 染色试剂盒染色，盖好盖玻片，放入烘箱内烘干，用显微镜观察破骨细胞，每张切片随机选取6 个视野进行破骨细胞计数（不规则长条形，胞浆呈红色），计算平均值。

1.2.7 实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative realtime polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA的表达取大鼠右侧上颌骨复制缺损处的骨组织，剔除牙周软组织后放入盛有液氮的研钵中，研磨成粉末，取100 mg粉末于离心管中，加入裂解液，室温下裂解5 min后离心，严格按照试剂盒说明书进行操作。取5 μL提取好的mRNA，按照试剂盒添加其余组分，加无菌无酶水补至30 μL，放入qRT-PCR 仪中。50℃、10min将mRNA逆转录为cDNA，PCR 反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性15 s，60℃退火30s，共45 个循环。β-actin 作为内参，根据Ct 值计算2-ΔΔCt。引物设计见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.8 Western blotting 检测NLRP3、Caspase-1、IL-1β 蛋白的表达取1.2.7 中研磨好的骨组织粉末，在冰上加入蛋白提取试剂盒中的裂解液，于涡旋仪上混匀后离心，按照试剂盒说明书进行操作，采用BCA 法测定蛋白浓度，SDS-PAGE 进行凝胶电泳，电泳结束后，浸泡于转膜液中将蛋白转移到PVDF 转膜纸上，放入3%脱脂奶粉封闭液中封闭1 h，加入一抗室温下孵育过夜，洗膜，加入二抗孵育1 h，在凝胶成像系统中曝光观察，以β-actin 作为内参计算灰度值。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.00 统计软件。计量资料以均数±标准差（）表示，比较用方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠空腹血糖的比较

对照组、模型组、炎症小体抑制组大鼠空腹血糖分别为（5.27±1.08）mmol/L、（18.74±4.17）mmol/L 和（18.08±3.98）mmol/L，经方差分析，差异有统计学意义（F=5.008，P=0.014），与对照组比较，模型组与炎症小体抑制组空腹血糖均上升（P＜0.05）。

2.2 各组大鼠骨代谢指标比较

对照组、模型组、炎症小体抑制组大鼠OPG、ALP 比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=4.278和1.202，P=0.024 和0.316），模型组OPG、ALP 低于对照组和炎症小体抑制组（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠OPG和ALP含量比较（n=10，）

表2 各组大鼠OPG和ALP含量比较（n=10，）

注：①与对照组比较，P ＜0.05；②与模型组比较，P ＜0.05。

2.3 各组大鼠牙槽骨HE 染色及Lane-Sandhu 评分比较

HE 染色结果显示，模型组大鼠牙槽骨缺损严重，可见大量炎症浸润细胞，炎症小体抑制组牙槽骨缺损程度低，炎症浸润细胞较少。见图1。

图1 各组大鼠上颌骨组织（HE染色×400）

对照组、模型组、炎症小体抑制组大鼠Lane-Sandhu 评分分别为（6.45±0.97）分、（3.98±0.61）分和（5.02±0.85）分，经方差分析，差异有统计学意义（F=22.666，P=0.000），模型组Lane-Sandhu 评分低于对照组和炎症小体抑制组（P＜0.05）。

2.4 各组大鼠破骨细胞数比较

TARP 染色结果显示，对照组、模型组、炎症小体抑制组大鼠破骨细胞数分别为（1.01±0.03）个/HP、（11.24±2.21）个/HP 和（8.01±1.68）个/HP，经方差分析，差异有统计学意义（F=106.447，P=0.000），模型组破骨细胞数高于对照组和炎症小体抑制组（P＜0.05）。见图2。

图2 各组大鼠上颌骨组织（TARP染色×200）

2.5 各组大鼠上颌骨组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA相对表达量比较

对照组、模型组、炎症小体抑制组大鼠上颌骨组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA 相对表达量比较，经方差分析，差异均有统计学意义（F=13.175、18.414 和23.672，P=0.001、0.000 和0.000），模型组大鼠上颌骨组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA 相对表达量高于对照组和炎症小体抑制组（P＜0.05）。见表3。

表3 各组大鼠上颌骨组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA相对表达量比较（n=10，）

表3 各组大鼠上颌骨组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA相对表达量比较（n=10，）

注：①与对照组比较，P ＜0.05；②与模型组比较，P ＜0.05。

2.6 各组大鼠上颌骨组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白相对表达量比较

对照组、模型组、炎症小体抑制组大鼠上颌骨组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β 蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=14.121、12.333 和10.932，P=0.001、0.000 和0.002），模型组大鼠上颌骨组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β 蛋白相对表达量高于对照组和炎症小体抑制组（P＜0.05）。见表4和图3。

表4 各组大鼠上颌骨组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白相对表达量比较（n=10，）

表4 各组大鼠上颌骨组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白相对表达量比较（n=10，）

注：①与对照组比较，P ＜0.05；②与模型组比较，P ＜0.05。

图3 各组大鼠上颌骨组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白的表达

3 讨论

牙槽骨位于上下颌骨边缘处镶嵌牙龈的位置，是上下颌骨的牙槽突出部分。一般情况下，随着年龄的增长及牙齿的不断咀嚼挤压会导致牙槽骨不断吸收，高度下降；另外，在牙周炎等一些病理或外力的作用下，也会导致牙槽骨的缺损[8]。纳米羟基磷灰石、类骨质羟磷灰石等材料已经广泛应用于人工修复牙槽骨缺损中[9]。但临床治疗中发现，牙槽骨缺损糖尿病患者接受治疗后，高血糖导致骨愈合缓慢甚至出现不愈合，造成人工修复失败，患者面临失牙风险。有研究显示，炎症因子在糖尿病大鼠骨折愈合中发挥重要作用[10]，NLRP3 炎症小体是各种炎症反应的重要部分[11]，因此探究抑制NLRP3 炎症小体对糖尿病大鼠牙槽骨缺损愈合的影响具有重要的临床意义。

牙槽骨缺损愈合过程也就是局部骨重建的过程，即破骨细胞释放酸液溶解旧骨，成骨细胞分泌骨胶原形成新骨，两种作用保持动态的平衡[12]，但糖尿病会引起患者机体骨代谢紊乱[13]，破骨细胞被激活，成骨细胞受到抑制，导致骨愈合受阻，牙槽骨缺损难以愈合。OPG 和ALP 是典型的骨形成标志[14-15]，OPG 又被称为破骨细胞分化因子。有研究显示，抑制OPG 的活性会降低破骨细胞的分化程度[16]。ALP 则广泛分布在机体各个组织中，成骨细胞的增殖分化会分泌ALP。本研究结果显示，NLRP3 炎症小体抑制组大鼠血清OPG 与ALP 出现不同程度的升高，说明抑制NLRP3 炎症小体可以促进成骨细胞的增殖与分化，抑制破骨细胞活性。通过HE 染色发现，模型组大鼠牙槽骨缺损严重，且炎症浸润细胞较多，但NLRP3 炎症小体抑制组牙槽骨缺损程度降低，并且炎症浸润细胞较少。并且与模型组比较，炎症小体抑制组骨再生Lane-Sandhu 评分升高，提示该组骨形成程度较高。TARP 特异性地分布在破骨细胞中，因此TARP 染色是检测骨组织中破骨细胞的常见方法，染色后破骨细胞呈红色。本研究结果表明，相比模型组，炎症小体抑制组破骨细胞数减少。既往研究显示，激活NLRP3 炎症小体活性后，关节组织中的破骨细胞数量上升[17]。

炎症参与糖尿病病程，并且影响骨代谢过程。李石岩等[18]研究发现，抑制NLRP3 活性可以促进骨缺损的修复。NOD样受体（NOD-like receptor，NLRs）参与机体固有免疫，NLRP3 是NLRs 的主要成员之一，在糖尿病状态下其表达上调。NLRP3 可以识别刺激信号并活化形成NLRP3 炎症小体。NLRP炎症小体会进一步刺激下游Caspase-1，活化的Caspase-1 刺激pro-IL-1β，形成炎症因子IL-1β。本研究结果显示，与对照组相比，模型组NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA 和蛋白相对表达量升高，NLRP3 炎症小体被抑制后，NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA 和蛋白相对表达量降低。

因此，抑制NLRP3 炎症小体可以抑制NLRP3/IL-1β 通路活化，促进成骨细胞的增殖与分化，抑制破骨细胞活性，从而促进糖尿病大鼠牙槽骨缺损的愈合。