视网膜缺血性损伤动物模型与发病机制的研究进展

秦亚丽，冀美琦，訾迎新，邓婷婷，韩梦雨，金明

视网膜缺血性损伤（retinal ischemic injury，RII）是许多眼底血管性疾病的病理基础之一，如视网膜血管阻塞、缺血性视神经病变等[1-2]。RII 导致视网膜组织内长期低灌注，并诱发不可逆的视神经细胞退行性病变，最终造成患者视力下降或视觉障碍。选择理想的RII 模型，深入探索其潜在的发病机制，可以为全面认识该病变并寻求有效的治疗方法提供研究基础。近年来，许多学者通过建立不同类型的急、慢性缺血性视网膜病变的动物模型，针对不同病变阶段的多个机制环节做了大量研究，取得了一定的进展。本文对近年来与RII相关动物模型与发病机制的研究进展进行归纳总结。

1 RII常见动物模型

用于研究视网膜疾病的动物主要包括大鼠、小鼠、猕猴、家兔、家猪、猫和犬等[3]。常见的视网膜缺血模型包括升高眼压法、视神经或血管结扎法、光动力或药物注射诱导法等。

1.1 升高眼压法

升高眼压法主要是通过输液管将37℃的生理盐水引入前房，增加输液管的高度使眼内压提升至70～90 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），维持时间一般为45～60 min，显微镜下可以观察到虹膜变白和视网膜动脉白化等现象[4]。这种方法多用于制作急性视网膜缺血或急性青光眼模型。也有采用前房注射聚苯乙烯珠诱导慢性高眼压模型，在单次注射聚苯乙烯珠后，高眼压至少能够维持3 个月，导致视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell，RGC）发生渐进性萎缩[5]。

1.2 视神经结扎或钳夹法

大鼠眼动脉在视神经鞘膜内与视神经伴行，采用视神经结扎或钳夹法等机械性损伤可有效阻断视网膜血供。KONRAD K 等[6]持续结扎大鼠球后视神经束60 min 后，观察到视网膜血流中断，视网膜电流图显示a、b 波振幅明显降低，超微结构观察中可见细胞核固缩和残留线粒体。JONAS JB 等[7]采用钳夹球后视神经束法制作恒河猴视网膜中央动脉（central artery retina，CRA）闭塞模型，钳夹时间为97～300 min，通过眼底照相和荧光素眼底血管造影证实CRA闭塞成功。在中老年动脉粥样硬化和动脉高血压的恒河猴中，CRA闭塞的持续时间与视网膜神经纤维层的可见性降低和视盘苍白程度之间具有相关性，CRA 闭塞的持续时间为240 min 或以上，神经纤维层几乎全部出现损伤和严重视神经萎缩[8]。

1.3 血管结扎法

双侧颈总动脉结扎（bilateral common carotid artery occlusion，BCCAO）或联合双侧椎动脉结扎，即2 或4 血管闭塞法，是研究视网膜缺血模型的常用方法[9]。BCCAO 诱导的低灌注性视网膜病变典型病理表现为视网膜神经细胞凋亡和胶质细胞活化增生[10]。有学者[11-12]通过建立BCCAO 模型，观察到视网膜动脉变细、静脉扩张等眼底表现，形态学研究显示视网膜感光细胞发生明显的病理性损害。局部血管结扎主要是将视网膜中央动脉、静脉和视神经束一起进行结扎，或剪开球后视神经鞘膜，仅分离并钳夹CRA，60 min后松开，可以观察到眼底视网膜血流中断和再灌注现象[13]。

1.4 光动力诱导法

此法通常采用注射诱导剂联合激光制作眼底分支血管缺血模型，单纯激光或单纯诱导剂干预并不能成模。WANG RS 等[14]通过注射血卟啉衍生物2 h 后再给予氪红色激光照射（波长647 nm）诱导前部缺血性视神经病变大鼠模型，病变早期可见视盘水肿，后期出现视网膜神经纤维层变薄。也有学者[15]采用注射赤藓红素B 染液加激光诱导制备后部缺血性视神经病变模型。国内有研究[16]采用光化学法诱导兔视网膜分支静脉阻塞模型，观察到阻塞区域单位面积内血液灌注量明显下降。

1.5 药物诱导法

常用诱导剂如血管内皮素-1（endothefin，ET-1），由于其强大的血管收缩作用，会导致视网膜缺血和氧化应激，加重RGC 凋亡和视神经轴突退行性损伤[17]。在大鼠眼球后植入ET-1 渗透式微型泵，通过荧光标记法监测发现了RGC 存活时间减少，伴有视神经血流灌注量减少68%[18]。在兔视神经周围植入ET-1 微型泵后，观察到2 周时视神经微血管中氧蛋白的表达增加，8周后RGC 数量减少，内、外核层随着时间的推移变得越来越薄[19]。

2 RII主要发病机制

2.1 氧自由基损伤

正常情况下，细胞内存在的氧自由基和氧化物处于较低水平，维持细胞内的多种生理活动。然而组织缺血、缺氧时活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量增加，通过介导线粒体呼吸链、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶、一氧化氮合成酶（nitric oxide synthetase，NOS）等多种途径产生细胞毒性作用[20]。NADPH 氧化酶的非吞噬细胞氧化酶（non-phagocytic cell oxidase，NOX）有许多亚型，其中，在视网膜血管内皮、周细胞、神经节细胞和小胶质细胞中表达的亚型主要包括NOX1、NOX2 和NOX4 等，其过度表达增加了ROS 的形成，诱发视网膜新生血管形成、毛细血管阻塞、血管渗漏和视网膜色素上皮细胞加速衰老等病变[21-22]。体外研究[23]发现，巨噬细胞和小胶质细胞的过度活化使诱导型NOS 表达上调，释放大量一氧化氮（nitric oxide，NO），过量NO 通过与超氧阴离子结合形成强氧化物，也会加重视网膜组织的氧化损伤。

2.2 线粒体功能障碍

线粒体通透性转移孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）介导的神经元细胞死亡被认为是RII导致线粒体功能障碍后的一个重要病理机制[24]。线粒体基质特异性蛋白亲环素D（cyclophilinD，CypD）是MPTP 的重要结构组成部分，在MPTP 的开放中起着关键作用，CypD 水平升高，导致局部缺血后线粒体膜电位异常和ROS 的过度生成[25]。线粒体转录因子A（mitochondrial transcription factor A，MTFA）是一种细胞核编码的DNA 结合蛋白，在线粒体基因表达和线粒体DNA 维护中起着重要作用[26]。KIM SY 等[27]研究发现，急性视网膜缺血可以诱发MTFA 蛋白和CypD 蛋白的过度表达，二者是介导视网膜神经细胞凋亡的重要因素。

2.3 兴奋性氨基酸毒性作用

Na+的细胞转运依赖于Müller 细胞内谷氨酸-天冬氨酸转运体（glutamate-aspartate transporter，GLAST），GLAST 的丧失会导致视网膜神经细胞退行性损害[28]。兴奋性氨基酸转运蛋白-1（excitatory amino acid transporter-1，EAAT-1）的功能紊乱往往是导致兴奋性细胞死亡的关键因素[29]。研究[28]发现，视网膜缺血、缺氧时激活p38 丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）信号通路，肌动蛋白细胞骨架不稳定，使细胞膜上Na+/K+-ATP 酶减少，细胞能量生成障碍，Müller 细胞内Na+浓度增加，对细胞外谷氨酸的摄取减少，导致Ca2+通道异常开放，细胞内Ca2+超载，激活线粒体膜上半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）通路，细胞色素C 释放增加，启动细胞凋亡。Ca2+超载导致的线粒体功能障碍引起氧自由基过量释放，加重氧化损伤，使神经元的结构和功能受到破坏，直到死亡，被称为兴奋性神经毒性作用[30]。

2.4 炎症反应

视网膜缺血时，组织中许多炎性因子和趋化因子被激活，如白细胞介素-1α（interleukin-1α，IL-1α）过度表达，细胞间粘附分子-1（intercellular adhesion molecule，ICAM-1）、组织金属蛋白酶抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等含量增加，趋化蛋白如细胞因子诱导的中性粒细胞化学引诱物（cytokine-induced neutrophil chemoattractant，CINC）和巨噬细胞炎症蛋白（macrophage inflammatory protein，MIP）等表达水平也明显增加[31]。在眼缺血综合征模型中发现，Toll 样受体（Toll-like receptors，TLRs）介导的髓样分化因子（myeloid differentiation factor88，MYD88）信号通路被激活，并启动下游炎症信号，激活核转录因子（nuclear factor-κB，NF-κB）和转录因子激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）等，进一步调控炎性因子的表达[32]。

2.5 细胞凋亡

细胞凋亡是一种在多种内源性或外源性因素诱导下，相关基因调控机制被激活，导致细胞发生特异性程序化死亡的现象。缺血时ROS 过度释放，对B 细胞原癌基因（B-cell lymphocyte/leukemia-2，Bcl-2）家族参与的神经细胞凋亡具有调控作用[33]。Bcl-2 为凋亡抑制蛋白，主要位于线粒体外膜，拮抗细胞质内的促凋亡因子对线粒体的攻击；Bcl-2关联X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）为凋亡促进蛋白，与线粒体内膜的腺苷转位因子和外膜的电压依赖性阴离子通道结合，介导线粒体跨膜通道开放，释放细胞色素C 进入细胞质，激活细胞质内一系列促凋亡因子，最后激活下游Caspase-3，完成蛋白质降解。在视网膜缺血模型中观察到，RGC层、内核层和内、外丛状层可见Bax蛋白表达增加、Bcl-2表达降低现象[34]。GALINA D 等[4]将RGC 进行氧糖剥夺离体培养实验发现，细胞中有引发坏死的受体相互作用蛋白激酶（receptor-interacting protein kinase，RIPK）表达。MESTER L等[35]发现视网膜低灌注可以诱导细胞毒性信号通路中的c-Jun 氨基末端蛋白激酶（c-Jun N-terminal protein kainse，JNK）和MAPK 磷酸化，在介导缺血诱导的视网膜神经元退行性病变过程中发挥了重要作用。

3 小结

本文总结发现，RII与脑低灌注损伤关系密切，已成为神经科和眼科等领域交叉疾病的研究热点。诱导RII 动物模型的方法以血管压迫类或血管结扎类为主。氧自由基损伤是视网膜缺血发病机制的关键环节，并伴随出现线粒体能量代谢障碍、兴奋性氨基酸毒性作用等现象，最终导致视网膜神经细胞凋亡的结局。因此在本病的治疗上，缓解视网膜缺血、缺氧状态，阻止细胞凋亡的发生与加重，是改善视网膜神经细胞功能，进而提高患者视觉质量的关键点。在今后的工作中，还需要更深入地展开RII的防治研究。