PIK3R2基因错义变异所致MPPH综合征I型患儿遗传学分析

阮妙华，胡思思，周晓军，石佳旻，陈源，朱棉棉，王楸，王丹

温州医科大学附属第一医院 儿科，浙江 温州 325015

巨脑畸形-多小脑回-多指（趾）畸形-脑积水（megalencephaly-polymicrogyria-polydactylyhydrocephalus, MPPH）综合征在线人类孟德尔遗传数据库（Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM）编号6603387，是一种罕见的常染色体显性遗传病[1]，分为MPPH I型、II型和III型，以脑积水、巨脑畸形、多小脑回、脑室扩大、轴后多指（趾）、癫痫发作、全面性发育迟缓伴极重度智力障碍等临床表现为特点，胎儿期最常见的表现为脑积水，新生儿期以巨脑畸形为特点，总体临床预后不良。MPPH由MIRAZAA等[1]在2004年首次提出，其中由PIK3R2基因突变引起的MPPH I型综合征，截至2021年12月31日，世界范围内可检索到16例完整临床案例报 道[2-14]。目前国内未见相关病例报道。本研究对1例智力运动发育相对落后，特殊面容和先天性脑积水的患儿进行了基因检测，探讨其遗传学病因。

1 对象和方法

1.1 对象

1.1.1 一般情况：患儿，男，出生后不久因“头围增大”就诊。患儿系第4胎第2产，出生胎龄38+5周，出生体质量3.43 kg。其母孕22周胎儿超声提示脑积水，家属拒绝行进一步产前检查。入院查体发现特殊外貌，前额突出，眼距宽，耳位低，前囟 3.5 cm×4.5 cm，平坦，头围40 cm（＞3 SD），乳距宽，见图1。父母表型均正常，系非近亲结婚，家族中无类似患者。

图1 先证者的临床表型

1.1.2 随访：出生后第2天头颅MRI示两侧脑室枕角少许积血伴幕上脑室轻度扩张，全脑对称性两侧额颞枕叶多小脑回畸形；脑电图检查未见明显异常。出生后19个月门诊随访：头围53.4 cm（见图1），前囟2 cm×2 cm，语言认知及运动发育相对落后，只会叫爸爸、妈妈；能独走，不会跑跳，无癫痫发作。GESELL心理学检查量表提示发育商77，提示边缘状态（76≤DQ≤85）。复查头颅MRI提示轻度幕上脑积水，渗出脑室旁脑白质髓鞘发育不良（见图2）。

图2 头颅MRI检查结果

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取：在征得其父母知情同意后，采集先证者及其父母的外周静脉血样各5 mL，用北京天根生化科技有限公司生产的试剂盒提取基因组DNA。

1.2.2 全外显子组测序和Sanger测序验证：使用IDT公司xGen®Exome Research Panel v2.0捕获探针，并用NovaSeq6000测序仪（美国Illumina公司）进行高通量测序（由北京智因东方转化医学研究中心完成）。测序目标区域覆盖度＞99%，20×覆盖度达到98%，捕获效率为0.89。最后根据二代测序的结果对候选变异位点进行Sanger测序验证序，同时对其父母进行检测。

1.2.3 生物信息学分析：用Mutation Taster （http://www.mutationtaster.org/）、SIFT（http://sift/bii/a-star.edu.sg/）、PolyPhen-2、PROVEAN、CADD（https://cadd.gs.washington.edu/）等软件对变异位点的有害性进行预测。通过Clustal X-2.1将变异氨基酸与另外7个物种的氨基酸序列（来源：http://www.nci.nlm.nih.gov/homologene）进行比对，包括黑猩猩（Pan troglodytes）、家鼠（Mus musculus）、牛（Bos taurus）、狐狸（Propithecus coquereli）、骆驼（Camelus ferus）、豹（Pantherophis guttatus）、海龟（Dermochelys coriacea），以分析变异氨基酸的保守性。根据美国医学遗传学与基因组学会（American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG）指南，评估变异的致病性。

1.2.4 蛋白模型分析：采用Swis-Pdb Viewer 4.0.1软件构建变异前后的蛋白空间模型，分析变异前后氨基酸相互作用力的变化（PDB，hppt://www.rscb.org/pdb/home/home.do，PDB ID:1AUT）。

2 结果

2.1 基因变异检测结果 全外显子检测提示，先证者PIK3R2基因（NM-005027）存在c.1117G＞A杂合变异（见图3A），造成PIK3R2蛋白第373位的甘氨酸替换为精氨酸。先证者父母均未检测到相同变异（见图3B、图3C），提示其为新发（de novo）。该变异在国外有相关报道，但国内尚无报道，本案例为国内首例报道。

2.2 生物信息学分析结果 c.1117G＞A变异位于PIK3R2基因的第10号外显子。该变异位于SH2区域（见图4A）。PolyPhen-2软件预测c.1117G＞A为可能致病；Mutation Taster、SIFT、CADD、PROVEAN软件预测c.1117G＞A为致病。由PIK3R2编码的P85β调节亚基，有4个重要的结构域：一个Src同源3 （Sh3）结构域和一个Rho-Gap同源区域和两个Src同源2（Sh2）区域。c.1117G＞A变异导致的p.Gly373Arg变异位于SH2结合域（见图4B）。用Clustal X软件对7种同源物种（哺乳类）的氨基酸序列保守性进行比对，结果表明该位点在8个物种中高度保守（见图5）。 根据ACMG指南，判断该变异为致病性（PS2-Very_Strong+PS4+PM1+PM2+PP3）。

图4 PIK3R2蛋白的结构模型以及野生型和变异蛋白中变异位点的局部结构

图5 PIK3R2基因c.1117G＞A变异的进化保守性分析

2.3 蛋白模型分析 用Swiss-Pdb Viewer软件构建野生型与变异型蛋白的结构模型。野生型PIK3R2蛋白Wild 373与Arg370形成一个氢键，维持了该区域的稳定结构，见图4C。该位点发生变异后，Gly373Arg与PIK3CA（绿色）的370Asn之间又形成一个氢键，见图4D，改变了蛋白结构，影响PIK3R2蛋白三位结构的稳定性，从而改变其功能和（或）活性。

3 讨论

MPPH是一种罕见的常染色体显性遗传病，国外已报道近16例由PIK3R2变异引起的MPPH I，但国内目前未见报道；因此，含本例在内目前共17例报道，其中最常见p.Gly373Arg变异15例；罕见变异包括p.Leu401Pro变异1例和p.Asp557His变异1例。MPPH患者临床表现为巨脑畸形，多小脑回以及大脑皮层畸形，部分患者存在癫痫发作、全面发育迟缓以及智力障碍等并发症。见表1。本例先证者因先天性脑积水就诊，表现为特殊面容、巨脑、智力、运动及语言发育相对落后，上述表型与文献报道相符[2-14]。 先证者PIK3R2基因存在c.1117（exon10）G＞A杂合变异，通过Mutation Taster等软件预测为致病性。先证者父母表型正常，相应位点未发现变异，符合常染色显性遗传的特点。

表1 包括本例在内的17例MPPH I型患儿的临床表型

MPPH的临床表型和巨脑-毛细血管畸形-多小脑回综合征（megalencephaly-capillary malformation-polymicrogyria syndrome, MCAP）非常相似。两者是一组共同发育相关的脑发育异常综合征[6，15]，前者主要表现为进行性大脑、多小脑回和多指（趾）畸形，后者主要表现为进行性巨脑、多小脑回、毛细血管畸形、并指和结缔组织发育不良。MCAP和MPPH综合征的大部分主要特征可分为5类：①早期过度生长；②血管异常；③远端肢端异常；④大脑皮质发育畸形；⑤结缔组织发育不良。这两种综合征的巨脑畸形都相当显著，头部大小高达 10 SD。虽然这些综合征的表型在很大程度上是重叠的，但可以根据躯体特征加以区分，因为与MCAP相比，MPPH缺乏皮肤血管形成、躯体过度生长、结缔组织发育不良和并指等显著躯体畸形。MCAP可与非对称性脑过度生长（半巨脑）或身体过度生长（节段性过度生长或半肥大）有关，多数MPPH患者的大脑和身体受累呈对称。仅报道的MPPH患者的躯体特征包括：约40%的患者出现轴后多指（趾）畸形，以及轻微的面部畸形特征，如突出的额头和低鼻梁等，这些特征大多继发于脑组织的增加。MCAP与许多出生时就出现的其他临床表型有关，例如皮肤血管畸形，特别是面部和皮肤的毛细血管畸形；并指和多指；结缔组织发育不良和局灶性或节段性身体过度生长；而MPPH除了轴后多指畸形（在报道的个体中约50%），目前报道的案例一致性躯体特征尚不多。由于MPPH的临床表现异质性，目前没有确定的临床指南，诊断相对困难，因此有赖于基因检测技术，如MPPH可能是由PIK3R2、AKT3和CCND2突变引起的；而MCAP与PIK3CA突变有关。本例患儿全外显子检测提示PIK3R2基因c.1117G＞A（p.Gly373Arg）错义变异，可排除MCAP综合征，且本案例为国内首例报道。

PIK3R2基因位于19p13.11区，编码由728个氨基酸组成的PIK3R2蛋白。对人、黑猩猩、牛、家属、骆驼等多个哺乳动物物种的PIK3R2蛋白的氨基酸序列进行的比对提示，其第373位的甘氨酸高度保守。国外已有多例携带PIK3R2基因变异的家系报道，其常见的PIK3R2变异位点包括p.Asp557His、p.Gly373Arg和p.Leu401Pro。本例发现的变异位点c.1117G＞A（p.Gly373Arg）最为常见。

既往文献报道，磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）-AKT-mTOR通路（mTOR-通路）[16-17]中的基因变异会导致广泛的大脑和身体发育障碍。MPPH和MCAP的发病均与该通路的过度活化导致过度生长障碍有关，故两者的临床表现巨脑存在显著的重叠。PIK3R2基因位于19号染色体，编码IA类PI3K的P85β调节亚单位[18]，是mTOR途径的上游组成部分[19]。PI3K是独特且高度保守的细胞内脂质激酶家族的成员[20]， 可磷酸化磷脂酰肌醇和磷酸肌醇的3’-羟基，该反应导致许多错综复杂的细胞内信号通路的激活，包括PI3K-AKT-mTOR通路[21]，在细胞的增殖、生长、新陈代谢、迁移和分泌中起着重要作用。P85β调节亚基通过调节催化亚基的稳定性、构象和定位来调节PI3K的活性[22]。P85β调节亚基由一个Src同源3（Sh3）结构域和一个Rho-Gap同源区域和两个Src同源2（Sh2）区组成，这两个区域通过一个称为SH2间区（i-sh2）的螺旋线圈区域相连，以介导P85β调节亚基与催化亚基的结合[12，14，19]。其中Sh2结构域是一个约100个氨基酸残基的蛋白质结构，作为细胞内信号级联的调节模块，通过与含有磷酸酪氨酸的靶肽在序列特异性中的高亲和力相互作用，识别磷酸化酪氨酸的3～6个残基C末端，并严格依赖于磷酸化方式。有研究[11]成功建立了人类最常见的PIK3R2变异p.G373R（小鼠p.G367R）小鼠模型。这些小鼠中，显示PI3K-AKT-mTOR通路被过度激活和脑过度生长，小鼠出现的巨脑和脑电变化都与人类表型重叠。证实了PI3K复合体的变异与广泛的脑和器官过度生长综合征有关，促进细胞生长可能是通过蛋白质S6磷酸化增加介导的蛋白质合成增加所致。PIK3R2变异诱导的mTOR-通路激活，导致大脑细胞增大，是临床表型相关巨脑最可能的机制。本案例先证者的p.Gly373Arg变异位于SH2结构域，导致带中性电荷的甘氨酸被带正电荷的精氨酸取代后，蛋白质的局部理化性质可能会发生变化。另外变异后形成新的氢键，结构的改变可能会进一步导致蛋白质功能的变化。同时该患儿存在语言认知发育及运动相对落后，但无癫痫发作，无轴后多指等畸形，与既往文献报道表型存在异质性，考虑如下：①不同的基因变异导致不同的表型，如本例PIK3R2致病变异位于SH2-1结构域，而既往文献报道的部分病例位于SH3结构域附近。②基因的功能受到多种因素的影响，包括翻译后修饰、基因-基因相互作用、环境等。③另外，目前该基因变异以国外报道为主，推测可能存在不同种族基因表型共分离。因此，同一基因的变异可能会导致不同个体的不同结果。综上，PIK3R2基因第10外显子c.1117G＞A（p.Gly373Arg）杂合变异可能是本例患者罹患MPPH的原因，其确切的致病机制仍需进一步的基因表达和功能实验加以验证。