基于网络药理学和分子对接技术探讨归肾丸治疗围绝经期综合征的有效成分及作用机制

余惠，张永青，季晓黎

（成都中医药大学，四川 成都 610000）

0 引言

围绝经期综合征（menopausal syndrome，MPS）是指女性绝经前后由于卵巢始基卵泡储备逐渐耗竭导致激素波动而出现的一系列躯体、精神、心理症状[4]。在此阶段的女性，随着卵巢功能逐渐衰退，雌激素水平开始下降，可面临一系列症状，如潮热盗汗，月经紊乱，头晕心悸等。治疗上西医主要采用激素，但长期服用激素会使心血管疾病、脑血管意外、子宫内膜病变、卵巢癌等发病率增加。中药在调节女性内分泌方面具有独特优势，不良反应少，作用持久，且易于接受[5]。归肾丸是治疗MPS疗效明确的经典方，方中重用熟地滋补肾阴；山萸肉滋补肝肾，山药滋肾补脾，助君药滋阴之力，菟丝子滋补肾精，杜仲温补肾阳，共为辅药；枸杞养阴益精，当归补血调经，茯苓渗湿健脾，合为佐使药。全方以滋阴为主，兼补肾阳，共奏滋阴补肾之功[6]。本研究拟用网络药理学技术，通过构建“药物成分-作用靶标-疾病靶标”网络，从分子层次阐释归肾丸治疗MPS作用原理，挖掘出归肾丸治疗MPS的潜在作用机制。

1 资料与方法

1.1 归肾丸有效活性成分及相应靶标的筛选

登录TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），将归肾丸中的药物依次输入进行检索，设置OB＞30%、DL＞0.18，获得药物有效活性成分并收集对应的靶标。应用蛋白质数据库（UniProt），将获得的靶标进行通用名称注释。

1.2 围绝经期综合征靶标的收集

登录Gene Cards数据库（https：//www.genecards.org/）、OMIM数据库（https：//omim.org/），依次输入关键词“Perimenopausal syndrome”，“Climacteric syndrome”，“MPS”，检索获得围绝经期综合征的相关靶标，将检索获得的所有疾病靶标进行汇总。

1.3 归肾丸活性成分靶标与围绝经期综合征共同作用靶标的获取

运用Venny2.1软件绘制归肾丸活性成分靶标与MPS相关靶标关系的韦恩图。图中交集的部分为两者的共同作用靶标，通过韦恩图可得到共同作用靶标的数目，得到的共同作用靶标数目越多，表明两者之间的关系越紧密。

1.4 靶点蛋白相互作用图（PPI）网络的构建

将通过韦恩图取交集得到的共同作用靶标上传至STRING数据库，得到靶标蛋白互作网络图，保存其为TSV格式图片[7]。通过靶点蛋白相互作用图可得到归肾丸治疗MPS的核心靶标。

1.5 中药-成分-靶点网络构建

将PPI 网络图导入 Cytoscape3.7.2软件，构建“中药-成分-靶点网络”图，药物活性成分和作用靶点以“节点”表示，节点之间的相互作用以“边”表示[8]。计算网络拓扑参数，以靶点在网络中的度（degree）值的大小来筛选归肾丸治疗MPS的关键靶点，度值排前的关键靶点即为归肾丸治疗MPS的关键靶点。由此筛选出的关键靶点可作为接下来分子对接的对象。

1.6 GO和KEGG富集分析

借 助R语 言 利 用Bioconductor软 件（http：//www.bioconductor.org/install/），将两者的共同作用的靶点进行GO和KEGG通路富集分析，并将得到的分析结果进行可视化。

1.7 分子对接

将1.5中得到的关键靶点输入PDB数据库（http：//www.rcsb.org/），下载3D蛋白质结构，导入PyMol 2.3.4软件（https://pymol.org/2/）对关键蛋白进行处理后，保存后导入 Autodock 4.2.6 软件（http://autodock.scripps.edu）再次进行处理。在 TCMSP 数据库中下载对接成分，保存为“mol2”结构，利用 Autodock 进行核心成分的分子对接。

2 结果

2.1 归肾丸有效活性成分及相应靶标的筛选

从TCMSP数据库中获得归肾丸总化合物896个，设置OB＞30%及DL＞0.18后得到有效化学成分139个，去除重复项后共获得有效活性成分120个，选取前10个有效活性成分（见表1）。

表1 归肾丸中列举的前10个有效活性成分

2.2 围绝经期综合征靶标的收集

登录GeneCards、OMIM数据库输入关键词“Perimenopausal syndrome”，“Climacteric syndrome”，“MPS”，筛选出围绝经期综合征3049个相关靶点。

2.3 归肾丸活性成分靶标与围绝经期综合征共同作用靶标的获取

应用Venny2.1软件，将归肾丸120个有效活性成分靶标与围绝经期综合征3049个相关靶标输入后得到韦恩图（见图1），得到两者共同作用靶标129个。

图1 归肾丸有效活性成分靶标与围绝经期综合征相关靶标的韦恩图

2.4 PPI网络图的构建及分析

登录STRING数据库，将通过韦恩图取交 集得到的共同作用靶标汇总表上传，由此可得到靶标蛋白互作网络图，（如图2）。

图2 共同作用靶标蛋白互作网络

2.5 中药-成分-靶点网络构建及分析

将PPI 网络图导入 Cytoscape3.7.2软件，构建“中药-成分-靶点网络”图（见图3），将链接靶标数量进行降序排列，可得到归肾丸治疗围绝经期综合征的前5位有效活性成分，依次为槲皮素、豆甾醇、山奈酚、表儿茶素、β-谷甾醇；将链接活性成分数量进行降序排列，可得到归肾丸治疗围绝经期综合征的前3位主要靶标，依次为RELA、PGR、SLC6A3。利用R语言软件获取核心靶标，选取排名靠前的靶标，包括AKT1、ALB、IL6、VEGFA、CASP3等（见图4）。

图3 归肾丸治疗围绝经期综合征活性成分-共同靶标互作网络

图4 邻接节点数排名前30位的核心靶标

2.6 GO及KEGG分析

通过Bioconductor软件对共同靶点进行GO及KEGG分析，设置P＜0.05，借助R语言软件完成。可得到146个GO分析结果（见图5）。从图中可见归肾丸治疗MPS的生物过程主要是参与DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子结合、细胞因子受体结合等方面。KEGG分析结果得到159个（见图6）。从图中可见归肾丸治疗MPS的关键信号通路有糖尿病并发症中的AGE-RAGE、TNF、HIF-1信号通路。

图5 归肾丸对MPS作用的前20位GO功能分析结果

图6 归肾丸对MPS作用的前20位KEGG通路分

2.7 分子对接

为讨论网络药理学预测的准确性，我们在网络图中选取degree较高的前5个成分（槲皮素、豆甾醇、山奈酚、表儿茶素、β-谷甾醇）和degree较高的4个靶点（JUN、RELA、MAPK1、IL6）在Autodock 4.2.6 软件中进行分子对接。成分与靶点结合能形成的氢键数目或构成π-π结合是决定结合能力的重要指标之一，而结合能越低则表明亲和力越强，氢键数目越多则结合越稳定[9]。如表2所示，成分与靶点均具有一定的亲和力，其中表儿茶素与RELA、JUN结合具有良好稳定性，槲皮素与JUN有良好的稳定性，其余大多数药效成分能与对接靶点构成氢键增强稳定性，其中槲皮素、山奈酚、表儿茶素可与RELA形成π-π结合，这有助于增强结构稳定性。对上述对接结果利用 PyMol 2.3.4 软件绘图（图7），以上分子对接结果表明，表儿茶素、山奈酚、槲皮素等成分可能是归肾丸治疗围绝经期综合征的潜在有效活性成分，可能通过JUN、RELA、MAPK1、IL6这些靶点发挥作用。

表2 核心成分与靶点的结合情况

图7 蛋白对接构象

3 讨论

古代医籍对围绝经期综合征无专篇记载，多散见于“年老血崩”“脏躁”“百合病”等病证中[10]。如《金匮要略》中指出：“妇人年五十所，暮即发热，手掌烦热，唇口干燥[11]。”处于围绝经期阶段的妇女，天癸逐渐枯竭，冲任逐渐虚衰，肝肾虚损，气血失调，脏腑功能、肾之阴阳趋于失衡状态[12]。因此本病的治疗关键在于调补肾之阴阳，使其肾中阴阳平衡，气血和调，冲任不虚，则围绝经期症状可得到有效缓解。归肾丸是《景岳全书》中的经典方，能够调整脏腑功能，使人体内气机平和，阴阳达到平衡。在现代临床运用中，我们只要准确把握疾病阴阳失调之病机，便可灵活运用此方进行加减治疗各种阴阳失衡所导致的疾病。因此，我们推断归肾丸能够明显改善围绝经期妇女的临床症状，且在多项临床研究中能够得到证实，但对其具体治疗作用机制知之甚少，因此，本研究拟用网络药理学技术，从分子层次阐释归肾丸治疗MPS作用原理，分析其治疗MPS的具体作用机制。

TCMSP数据库筛选及关键节点推断出槲皮素、山柰酚、豆甾醇、谷甾醇等可能为治疗围绝经期综合征的关键活性成分。槲皮素、山萘酚具有很好的抗炎、抗氧化应激等卵巢保护作用，能够促进卵巢卵泡发育和成熟。豆甾醇、谷甾醇对去卵巢小鼠内源激素不平衡状况可以明显改善，而β-谷甾醇可明显促进卵巢颗粒细胞分泌雌激素E2[13]。PPI网络拓扑分析显示,ALB、IL6、VEGFA等可能是归肾丸治疗围绝经期综合征的核心靶标。女性排卵一直被认为是一个复杂的炎症反应过程，而数据表明ALB的治疗机制是通过对炎症和氧化应激的调节发挥作用[14]。IL-6 在体内外均可以调节胎鼠生殖细胞的存活、增殖和分化。EGFR能促进卵母细胞的成熟及卵巢颗粒细胞的增殖分化，还能调节激素的分泌从而影响垂体功能并在卵泡发育过程中发挥重要作用。

KEGG分析显示，归肾丸治疗围绝经期综合征的主要信号通路是糖尿病并发症中的 AGERAGE、TNF及HIF-1信号通路。研究表明，抑制AGE-RAGE信号通路，可以降低氧化应激与炎症反应，维持内环境稳态[15]。而TNF信号通路是核心炎症信号通路，可通过发挥炎症作用从而影响卵巢颗粒细胞来调节卵泡成熟和排卵。此外，HIF-1信号通路可促进卵巢发挥其生理功能，防止卵巢过早衰竭。由此可见，归肾丸中的山柰酚、豆甾醇、槲皮素等有效活性成分可能是通过介导以上关键信号通路发挥促进卵泡发育、调节激素水平、抗炎等药理作用来改善女性围绝经期症状。

综上所述，归肾丸可能通过山柰酚、豆甾醇、槲皮素等有效活性成分，作用于JUN、RELA、MAPK1、IL6等关键靶点，其中主要涉及糖尿病并发症中的AGE-RAGE、TNF及HIF-1等关键信号通路来实现治疗围绝经期综合征的目的。因此，本研究表明，归肾丸治疗围绝经期综合征呈现出多成分、多靶点、多通路的作用优势，可为后续中医药治疗围绝经期综合征的科学研究和临床应用提供参考依据。