HNTs-NaClO2复合材料的制备及抑菌效果

谷娜，赵东亚，高金龙，林翠，任伟杰，王田田，刘欣伟

（1 河北科技大学理学院，河北 石家庄 050018；2 河北科技大学化学与制药工程学院，河北 石家庄 050018）

细菌是借助人体皮肤黏膜表面的一些特殊成分和结构附着在人体皮肤黏膜表面，然后以不同的方式引起疾病[1]。虽然细菌和其他微生物可以促进自然界物质的代谢循环，但不受控制地生长会损害人类健康，甚至阻碍经济发展[2]。抗生素因其优异的杀菌能力而成为最被接受的治疗方法。然而，随着多重耐药菌的进化，传统抗生素的药效逐渐下降，可能会产生超级细菌，从而导致更严重的后果[3]。开发新的抗生素费时费力，导致新抗生素持续缺失。更糟糕的是，现有抗生素耐药性的流行率在不断增加。因此，开发抗细菌感染的新型抗菌材料是最关键的问题[4]。随着科技的不断发展，新型抗菌剂逐渐走进了人们的视野。目前，抗菌剂已经广泛应用于化妆品[5]、食品包装[6]、塑料[7]、医疗卫生[8]、纺织品[9]等各个方面。

抗菌剂载体能通过不同方式对抗菌剂进行负载，可以实现抗菌药物缓释，且载体具有较大的孔径以及比表面积，能够扩大抗菌剂的负载效率[10-11]。埃洛石纳米管（HNTs） 化学式为Al2Si2O5(OH)4·2H2O，呈天然的中空管状结构，管内径为10～150nm，管长1～15µm。它的外表面含有和Si—O基团，内表面含有Al-OH基团，分别带有正负电荷，有利于其与各种不同电性粒子的结合[12]。HNTs 具有独特的纳米管状结构以及较大的比表面积，无细胞毒性，且具有良好的生物相容性[13]。Barman等[14]采用真空操作和超声技术将诺氟沙星作为模型药物负载到HNTs中并观察其抗菌活性。结果表明，该材料具有柔韧性，可以持续释放诺氟沙星，且有一定的抗菌性，细胞毒性研究表明HNTs本质上是生物相容的。因此，该复合材料能够维持药物输送，可以用于伤口愈合或其他医学应用。Lisuzzo等[15]利用壳聚糖和埃洛石纳米管之间的静电相互作用来制备具有向khellin 受控释放特性的杂化纳米结构，研究表明壳聚糖层包裹的埃洛石纳米管可以有效地用作药物输送系统。亚氯酸钠（NaClO2）可作为杀菌剂、漂白剂使用，可应用在空气净化[16]、食品安全[17]、消毒[18]等领域。由于亚氯酸钠自身没有缓释性，本文利用HNTs 作为抗菌剂载体，制备HNTs-NaClO2抑菌材料，对其释放以及抑菌性能进行探索，图1 为制备HNTs-NaClO2复合材料的实验流程。

图1 制备HNTs-NaClO2复合材料的实验流程

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

材料：埃洛石，石家庄腾瑞矿产产品贸易有限公司；亚氯酸钠，石家庄市科大绿源发展有限公司；硫代硫酸钠、六偏磷酸钠，天津市永大化学试剂有限公司；碘化钾，天津市科密欧化学试剂有限公司；淀粉，天津市永大化学试剂有限公司；重铬酸钾，莱阳市康德化工有限公司；大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，北京生物保藏生物科技有限公司；蛋白胨、牛肉膏、琼脂粉，天津市英博生化试剂有限公司。

仪器：X 射线衍射仪（XRD），日本Rigaku 公司D/MAX-2500 型；透射电子显微镜（TEM），德国电子有限公司JEM-2100 型；傅里叶红外光谱（FTIR），美国铂金埃尔默公司FTS-65A1896 型；场发射扫描电子显微镜（SEM），日本HITACHI 公司S-4800-I型。

1.2 HNTs的预处理

首先使用去离子水洗涤HNTs，除去HNTs 中不溶性杂质。称取HNTs 5.0g，加入到25mL的去离子水中，将其混匀，再向混合后的溶液中加入0.125g分散剂六偏磷酸钠，搅拌2h。将搅拌后的溶液离心，去除沉淀后，再将悬浮液进行离心，用去离子水洗涤3次后，将所得沉淀在60℃下真空干燥24h。将干燥后所得到的固体采用一定浓度的氢氧化钠溶液进行处理。将HNTs分散到氢氧化钠溶液中，超声30min，搅拌10h。将搅拌后的溶液离心，去掉上层碱液，过滤，水洗至中性，将滤饼在80℃真空干燥24h，得到碱处理后的HNTs。

1.3 HNTs-NaClO2的制备

根据行业标准《工业亚氯酸钠》（HG/T 3250—2010）[19]对亚氯酸钠溶液的浓度进行检测。本实验采用真空抽吸的方式制备HNTs-NaClO2复合材料。

称取一定质量的HNTs，置于饱和亚氯酸钠溶液中，边搅拌边抽真空，每隔30min关闭搅拌并卸下真空，5min 后继续抽真空。2h 后将所得溶液过滤得滤饼，40℃置于真空干燥箱内烘干24h，研磨，得样品备用，滤液用滴定法测定其含量。NaClO2负载量的计算如(1)所示。

式中，m0是溶液中亚氯酸钠的初始质量，g；mf是滤液中亚氯酸钠的质量，g；mads是HNTs 的质量，g。

采用单因素考察法探索负载工艺对NaClO2负载量的影响。

（1） 在保持其他条件不变的情况下，设置不同的搅拌时间分别为60min、90min、120min、150min、180min。

（2） 在保持其他条件不变的情况下，设置不同的浸泡时间分别为0min、 10min、 20min、30min、40min。

（3） 在保持其他条件不变的情况下，设置不同负载比例（HNTs∶NaClO2）分别为1∶3、1∶4、1∶5、1∶6。

1.4 HNTs-NaClO2的释放

将HNTs-NaClO2复合材料在中性介质中进行释放。称取一定量的HNTs-NaClO2复合材料置于试管中，加入10mL 的去离子水，充分混匀后静置，在一定时间后，从试管中取一定质量的上清液进行测定，同时在试管中加入等量的去离子水。采用碘量法测定溶液中的亚氯酸钠含量。根据式(2)计算亚氯酸钠的累积释放率。

1.5 HNTs-NaClO2的抑菌

根据《消毒技术规范第一分册》[20]配制Luria-Bertani（LB）液体培养基、LB 固体培养基和相应的菌悬液。采用抑菌圈法对HNTs-NaClO2进行评价。称取不同质量的HNTs-NaClO2复合材料，将其溶于灭菌水中，分别配制浓度为1.25g/L、2.50g/L、3.75g/L、5.00g/L、6.25g/L、7.50g/L 的样品。将灭菌后的LB固体培养基倒入无菌平板中，转动平板，使培养基在平板中厚薄均匀。静置，待其冷却凝固后，将菌悬液均匀涂布在含有培养基的平板上。用移液枪吸取20µL 不同浓度的样品溶液，滴加到灭菌后的滤纸片的表面，对照滤纸片滴加20µL 浓度为0.9%的生理盐水作为空白对照实验，然后将滤纸片平放在平板表面，盖好平板，置于37℃电热恒温培养箱倒置培养16～18h 后，观察结果，记录抑菌圈直径的大小。

1.6 急性经口毒性实验

根据《消毒技术规范第一分册》对HNTs-NaClO2进行急性经口毒性实验。采用霍恩（Horn’s）法对HNTs-NaClO2的半数致死量（median lethal dose, LD50）进行测定。选用18～22g SPF 级昆明种小鼠40只，随机分为4组，每组10只，雌雄各半。按2.15g/kgBW(BW 指体重)、4.64g/kgBW、10.00g/kgBW、21.50g/kgBW剂量对小鼠进行灌胃，灌胃容量为20mL/kgBW。另取SPF 级昆明种小鼠10 只，雌雄各半，灌入等量的生理盐水。给药后观察小鼠14 天内的毒性反应和死亡情况，记录各组动物的一般生理状况、进食饮水、活动状态、有无中毒状态和有无动物死亡，实验结束后将小鼠用颈椎脱臼致死法处死，进行解剖学检查。根据霍恩法LD50值计算用表计算小鼠的LD50值，表1为急性毒性分级标准。

表1 急性毒性分级标准

2 结果与讨论

2.1 HNTs-NaClO2复合材料的表征

2.1.1 XRD分析

图2 为原始HNTs、HNTs-NaClO2复合材料和NaClO2的XRD图谱。从图中可以看出，HNTs负载亚氯酸钠后的XRD 图与原始HNTs 和亚氯酸钠的XRD图谱明显不同，且HNTs负载亚氯酸钠的特征衍射峰较尖锐，结晶度较好。在12.15°、20.14°、24.94°分别对应原始HNTs 的(001)、(100)、(002)晶面峰，在31.75°、45.55°、54.05°分别对应NaClO2的(200)、(220)、(311)晶面峰。

图2 原始HNTs、HNTs-NaClO2复合材料和NaClO2的XRD图

2.1.2 FTIR分析

图3 为原始HNTs、HNTs-NaClO2复合材料和NaClO2的FTIR 图谱。与原始HNTs 和NaClO2的红外光谱图相比，负载饱和亚氯酸钠溶液的红外光谱图在843cm-1、434cm-1附近出现特征吸收峰，证明在HNTs成功负载亚氯酸钠晶体。

图3 原始HNTs、HNTs-NaClO2复合材料和NaClO2的FTIR图谱

2.1.3 TEM分析

图4 为原始HNTs 和HNTs-NaClO2复合材料的TEM 图。由图中可以看出负载后的HNTs 呈透明状，管径为50～100nm，管长为400～800nm，部分管体发生断裂，与原始HNTs 相比较，负载后的HNTs 表面有部分结晶，证明已经成功负载上亚氯酸钠。

图4 原始HNTs和HNTs-NaClO2复合材料的TEM图

2.1.4 EDS分析

表2 为原始HNTs 和HNTs-NaClO2复合材料元素质量分数，图5为原始HNTs和HNTs-NaClO2复合材料的EDS 图。从表2 的数据中可以得出在HNTs上有Na 元素和Cl 元素的存在，且比例接近1∶1，表明HNTs已经负载上亚氯酸钠。

图5 原始HNTs和HNTs-NaClO2的EDS图

表2 原始HNTs和HNTs-NaClO2元素质量分数

2.2 负载工艺对NaClO2负载量的影响

2.3 HNTs-NaClO2复合材料的释放结果

图6为负载比例对HNTs-NaClO2复合材料释放结果的影响。由图可以看出，在释放达到第4 天时，释放趋于平稳，负载比例为1∶4 时，其释放性能较好，累积释放量为1.43%。在释放初期，释放速率不断增大，增加到一定值后保持稳定持续释放，说明HNTs-NaClO2具有一定的缓释性。

表3 不同负载工艺对NaClO2的负载量的影响

图6 负载比例对HNTs-NaClO2复合材料的释放结果的影响

2.4 HNTs-NaClO2复合材料的抑菌结果

图7为HNTs-NaClO2复合材料负载比例为1∶4时的抑菌结果，表4为浓度对HNTs-NaClO2复合材料的抑菌圈直径的影响（±SDmm）。结果表明，HNTs-NaClO2复合材料对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用；随着样品浓度的增加，抑菌圈直径也随之增加，抑菌作用也随之增强。

表4 浓度对HNTs-NaClO2复合材料的抑菌圈直径的影响（±SD） 单位：mm

图7 浓度对HNTs-NaClO2复合材料抑菌结果的影响

2.5 急性经口毒性实验结果

表5 各组小鼠实验结果

度为4.64g/kgBW时，小鼠部分死亡，给药浓度为2.15g/kgBW时，小鼠均未死亡。根据霍恩法LD50值计算用表，样品对雌性小鼠的LD50为5.84g/kgBW，可信限为4.30～7.94g/kgBW，样品对雄性小鼠的LD50为5.01g/kgBW，可信限为3.44～7.30g/kgBW。雌雄小鼠的LD50均大于5.00g/kgBW，根据急性毒性分级标准，属于低毒级别。解剖后肉眼观察灌胃后死亡的小鼠内脏的颜色与对照组的内脏颜色明显不同。

3 结论

（1）通过XRD、FTIR、TEM、EDS 分析证明HNTs 已经成功负载上了亚氯酸钠，得到HNTs-NaClO2复合材料。通过改变HNTs 在饱和亚氯酸钠溶液中搅拌时间和负载比例可以提高NaClO2的负载量。

（2）释放实验结果表明，HNTs-NaClO2复合材料在第4 天时达到稳定期，稳定期浓度为1.43%。抑菌实验结果表明，HNTs-NaClO2复合材料对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有抑制作用。此外，急性经口毒性实验表明，HNTs-NaClO2对雌雄小鼠的LD50均大于5.00g/kgBW。

（3）HNTs-NaClO2复合材料具有一定的缓释性和抑菌性。HNTs-NaClO2复合材料具有潜在应用价值，仍需完善在应用方面（如纺织品的抗菌整理）的实验。