不同产前诊断指征孕妇胎儿染色体异常检测及随访结果分析

陈惠娟 刘小燕 刘 霖 肖媛媛 胡芷晴 张 浩 徐志红

四川省德阳市人民医院(618000)

染色体异常可引起基因的缺失、重复、重排，导致自发流产、胚胎畸形、出生缺陷[1]。染色体异常疾病目前尚无有效治疗方法，对高危孕妇产前诊断，对胎儿染色体异常者进行合理干预，是减少降低出生缺陷有效方法[2]。本文分析羊水细胞异常染色体核型的分布及不同产前诊断指征胎儿染色体异常检出情况，为临床有效干预提供参考。

1 对象与方法

1.1 对象

回顾性收集2018年1月-2020年6月来本院遗传咨询门诊就诊并行羊膜腔穿刺术产前诊断的3245例孕妇临床资料。产前诊断指征包括唐氏筛查高/临界风险、高龄、胎儿颈部透明带厚度(NT)值异常、B超发现多发畸形、不良妊娠史、无创产前DNA筛查(NIPT)染色体异常高风险、夫妻一方染色体异常、孕期用药及致畸因子接触史、夫妻一方先天异常、家族单基因疾病携带、要求诊断。年龄18～49岁，孕16～32周。所有孕妇术前签署知情同意书。本研究经院伦理委员会审批。

1.2 染色体检测方法

B超引导下行羊膜腔穿刺术，抽取羊水20ml分别装于2管15ml无菌离心管中，转移至产前诊断实验室离心。在超净工作台内严格无菌操作弃上清液，留取0.5ml制备为细胞悬液，分别接种于装有3.5ml羊水培养基的培养瓶中。置5%CO2培养箱中，37℃培养7天。将细胞置于倒置显微镜下观察细胞生长情况并换液。随后继续观察细胞生长，如培养瓶底可观察到较多较大克隆的贴壁细胞，并有较多圆而亮的细胞，便可收获细胞。将培养后的羊水细胞常规制片、G显带。显微镜下计数20个分裂相，选择5个分散较好带纹清晰的5个细胞分裂相进行核型分析，观察到异常核型加大中期分裂相计数和羊水细胞染色体的核型分析。羊水细胞染色体核型描述和命名依据人类细胞遗传学国际命名体制。选择同时进行基于二代测序技术的染色体拷贝数变异检测(CNV-seq)孕妇，B超引导下行羊膜腔穿刺术时，另取5ml羊水于离心管中，无菌转移至产前诊断实验室离心弃上清，根据TIANamp基因组DNA提取试剂盒(天根)说明书提取羊水细胞基因组DNA。根据NextSeq 550AR(安诺优达)试剂盒说明书进行文库构建、质量控制、测序。测序结果根据ACMG指南进行CNV评级。

1.3 统计学分析

应用SPSS 23.0统计学分析。使用(%)表示计数资料，χ2检验。P<0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 羊水细胞染色体异常核型分布

本研究分析的3245例羊水细胞样本，培养成功3244例，成功率99.97%；发现异常核型151例，异常检出率4.56%。异常核型分布见表1。

表1 151例羊水细胞染色体异常核型检出情况

2.2 染色体异常核型在不同产前诊断指征中检出情况

3244例羊水标本中染色体异常核型检出151例。不同产前诊断指征者异常检出率不同，其中NIPT染色体异常高风险检出率最高，其次为夫妻一方染色体异常，再次为NT值异常。在不同产前指征中以血清学唐氏筛查高/临界风险、高龄妊娠、B超多发畸形3个指征为主。各产前指征染色体异常检出率具有差异(P<0.05)，检出情况见表2。其中因夫妻双方携带同型地中海贫血基因行产前诊断的23例孕妇，19例为夫妻双方携带α地中海贫血基因，4例夫妻双方携带β地中海贫血基因。经产前诊断3例为α地中海贫血基因纯合突变，1例为β地中海基因纯合突变，并终止妊娠。见表3。

表2 羊水染色体核型高危因素与异常核型分析[例(%)]

表3 不同产前诊断指证者核型正常胎儿妊娠结局[例(%)]

2.3 产前筛查NIPT与血清学检测效率

本文NIPT染色体高风险孕妇55例，经产前诊断分析后发现NIPT对T21具有较高的准确率，对T18、T13准确率较差，对性染色体数目异常准确率最低。见表4。

表4 NIPT染色体异常与羊水诊断结果[例(%)]

2.4 CNV-seq 在不同产前诊断指征中检出情况

1089例行CNV-seq检测，染色体非整倍体检出37例，嵌合体检出5例，致病性CNV异常检出16例。B超检查异常及NIPT染色体异常高风险指征者染色体拷贝数变异(CNV)异常检测率最高。见表5。

表5 不同产前诊断指证者CNV-seq检测结果[例(%)]

2.5 妊娠结局

3244例中有2948例明确妊娠结局，随访率90.9%(2948/3244)，151例羊水细胞染色体异常核型中2例无明确妊娠结局。终止妊娠65例，活产83例。3093例羊水细胞染色体核型正常中有明确妊娠结局2799例，活产2778例，活产率为99.3%。21例因B超发现异常终止妊娠，14例经CNV-seq检测找到遗传学病因。见表3、表6。

表6 核型异常胎儿妊娠结局[例(%)]

3 讨论

3.1 产前诊断是检出染色体异常有效方法

染色体数目异常与结构异常可引起染色体疾病，有效检出染色体异常核型方法至关重要。多种筛查和诊断方法联合应用可相互补充提高诊断效率。对高危因素指征孕妇进行产前诊断，能有效检出异常染色体避免出生缺陷发生。本文分析回顾了3245例羊水标本检测结果，培养失败1例，成功核型分析3244例，包括染色体多态共检出异常核型151例，异常检出率为4.65%。常染色体数目异常主要以21三体核型为主，包括27例标准型、2例嵌合型，该疾病是最常见的染色体疾病，是产前诊断重要的目标疾病。其次为18三体核型，4例标准型、2例嵌合型，其发生率仅次于21三体综合征，是围产婴儿死亡的重要疾病之一。性染色体数目异常主要以克氏综合征最为多见，其次为特纳综合征嵌合体。克氏综合征在新生儿男婴中的发病率为1/660[3]。

3.2 NIPT高危指征中染色体异常检出率最高

无创产前检测是产前筛查的一种方法，检测基于孕期母体外周血胎儿游离DNA与母体游离DNA共同检测以判断胎儿非整倍体异常。相对于传统血清学产前筛查，具有更高的检出率、更低的假阳性率及假阴性率，因此越来越被临床医生及孕妇所接受[4]。本文中55例孕妇因NIPT检测为染色体异常高危人群行羊水染色体核型分析，其中21例NIPT提示有小于5Mb拷贝数变异，经CNV-seq检测出19例拷贝数变异，与NIPT筛查结构相符；另外1例羊水核型分析和CNV-seq检出缺失异常。NIPT对21三体综合征筛查效率最高，而对于性染色体异常筛查效率表现较差。有研究观察NIPT检测胎儿性染色体异常准确性发现，其对性染色阳性预测值较低，对性染色体嵌合者检出能力更为不理想[5]。

NIPT基本原理是基于母体外周血游离胎儿DNA来源于滋养层细胞，占游离DNA的15%～20%。因此当任何一方面出现异常都将导致不准确检测结果，如假阳性及假阴性。导致假阳性的常见也是主要原因是限制性胎盘嵌合，胎盘限制性三体嵌合其凋亡细胞DNA释放到母体循环系统导致假阳性结果。其次为母体存在自身嵌合现象、母体在目标染色体上存在拷贝数增加、母体罹患恶性肿瘤或双胎之一停止发育的胎儿将异常染色体DNA释放入母体循环均可导致假阳性结果。而导致假阴性结果的常见原因为母体循环中胎儿游离DNA浓度较低。当母体体重过大，母体循环血容量增加及大量脂肪细胞凋亡后其DNA释放入血导致胎儿游离DNA相对稀释；其次母体循环胎儿游离DNA含量随孕周增加而增加，因此孕周过小，胎儿游离DNA含量低于4%时会导致NIPT技术检测不出胎儿游离DNA而使结果出现假阴性；再次导致母体大量游离DNA释放入血的疾病如血栓栓塞、系统性红斑狼疮、维生素B12缺乏等均会使胎儿游离DNA浓度相对降低导致假阴性结果。在罕见情况下胎儿嵌合体与胎盘染色体不一致时也是导致假阴性结果的另一原因[4]。鉴于此，相对于母血清产前筛查即使NIPT对21三体综合、18三体综合征、13三体综合征具有更高的检出率和准确性，也不能仅仅依据其阳性结果做出诊断，需要行侵入性产前诊断以明确诊断。

我国2015年“高通量基因测序产前筛查技术试行规范”规定NIPT技术的目标疾病仍是21三体综合、18三体综合征、13三体综合征。尽管随着技术的不断发展对胎儿游离DNA性全基因组测序也能发现部分其他染色体非整倍体或结构异常，但一方面增加检测成本，另一方其准确性需进一步循证医学证实。因此NIPT技术不能完全满足产前筛查目的。国际产前诊断协会推荐的一线产前筛查方案为妊娠早期(11～13周+6)超声检查并测量NT结合母体血清绒毛膜促性腺激素、妊娠相关糖蛋白A水平检测，妊娠中期行胎儿结构超声筛查。确定一线筛查方案某一风险孕妇人群使用NIPT检测技术作为二线筛查的策略得到推荐[6]。同时妊娠中期结构超声筛查在胎儿重大结构异常检测中起重要作用。

3.3 NT在产前诊断中的价值

随着检测技术的不断提高，超声在检测胎儿异常中应用越来越广泛。其中NT这一胎儿结构成为妊娠早期胎儿染色体异常检测的超声指标。研究表明NT增厚不仅与胎儿染色体异常有关，同时还与遗传性综合征、结构异常、心脏发育异常等有关[7]。目前NT值作为妊娠早期胎儿非整倍体染色体异常的超声指标具有高的灵敏性和特异性[8]。在本文分析中NT值异常指征的胎儿染色体异常检出率为13.8%，仅次于NIPT高风险与夫妇一方染色体异常的指征，对筛查胎儿染色体异常有重要临床意义。

3.4 夫妇一方染色体异常及高龄孕妇更应重视产前诊断

随着我国人口政策调整，高龄孕妇增加，成为出生缺陷防控的重要对象。本文高龄孕妇染色体异常检出率为4.3%。随着母体年龄增长生成畸形配子的概率增加，易发生染色体不分离导致胎儿染色体“三体”疾病，如21三体综合征、18三体综合征、13三体综合征[9]。因此我国法律规定，针对高龄孕妇直接通过羊膜腔穿刺术取得胎儿羊水细胞进行产前诊断，避免因目前母血清产前筛查技术的局限性引起的漏筛、漏检、漏诊情况。高龄孕妇更应重视产前诊断，预防染色体异常患儿出生。在产前诊断指征中夫妇双方染色体异常者胎儿染色体异常检出率为25%，仅次于NIPT高危组。父母染色体出现平衡性改变时，其遗传物质剂量没有改变而不出现临床表型。但在生育过程中可能会形成不平衡性配子，胎儿将会出现严重临床表现，甚至不能正常发育至分娩。因此夫妇双方有染色体异常者是产前诊断高危指征之一，应当予以高度重视。

3.5 羊水细胞染色体核型分析可联合分子遗传检测方法

染色体G显带核型分析是经典的遗传学检测技术，是诊断染色体疾病的金标准，广泛应用于产前诊断及辅助生殖等领域[10]。但细胞培养生长情况、检验人员经验、有限的分辨率等因素限制了其对染色体疾病，尤其是染色体小片段缺失/重复异常的检出。本文2799例核型正常并有明确妊娠结局中，21例因后续发现B超异常终止妊娠，其中14例通过CNV-seq 检测发现拷贝数变异，找到遗传学病因。CNV-seq技术对CNV异常检测效力是染色体核型分析所不能达到的，因此在产前诊断中仅仅应用单纯的核型分析方法或仅使用一种检测技术均不能满足临床需求。核型分析联合CNV-seq检测可提高对染色体异常检出率[11]。但应注意平衡易位或倒位这类不涉及遗传物质丢失的改变，CNV-seq技术不能有效检出。目前各类检测技术在产前诊断应用过程中，逐渐形成联合应用模式，集各检测技术之优势相互补充其局限性。如核型分析联合CNV-Seq、核型分析联合染色体微阵列分析[12]，基于检测STR的QF-PCR联合CNV-seq、核型联合产前BoBs以到达到快速检测集9种核型不能检出的常见微缺失/重复综合征等等[13-14]。

NIPT高风险、母血清唐氏筛查高危是产前诊断指征。高龄、夫妻双方染色体异常、B超异常等指征仍应予以重视。经典的核型分析联合检测拷贝数变异的CNV-seq可提高染色体异常检出。针对各类产前诊断指征的染色体异常高风险孕妇行羊膜腔穿刺术，对胎儿染色体进行检查，可有效检出染色体异常胎儿，为遗传咨询及临床干预提高依据。