损伤相关分子——针刺起效过程中的“前哨兵”

李亚男，徐枝芳，吕中茜，公一囡，马 婕，郭 义

(天津中医药大学，天津 301617)

针灸疗法作为中医疗法的重要组成部分已经在中国应用了数千年，尽管有部分高质量证据证明针灸对某些疾病有效，但针灸进入主流医学仍然面临两大挑战：一是缺乏有力的证据排除针灸安慰效应；二为针灸如何起效缺乏公认的科学机理[1]。笔者所在团队提出针刺作为一种机械性刺激，通过施行提插或捻转手法，造成穴区微损伤及局部物理和化学信息变化，在针刺效应启动中发挥重要作用[2]。损伤相关分子(Damage-associated molecular patterns，DAMPs)是组织或细胞受到损伤、缺氧及应激等刺激后释放到细胞间隙或血液循环中的一类内源性危险信号，可被Toll样受体、RIG-1样受体或NOD样受体等模式识别受体(Pattern Recognition Receptors，PRRs)识别，进而诱发组织局部炎性细胞浸润，释放炎性因子，有助于机体做出防御反应，进而消除内、外源致病因素，使机体内环境恢复稳态。两者具有密不可分的关系，因此本研究系统分析了损伤相关分子参与针刺起效过程的相关研究，并讨论研究如下。

1 针刺的固有属性

针刺是一种微创伤性机械刺激，提插捻转等针刺手法会引起穴区的物理变化，如局部组织发生形变、位移、结缔组织缠绕与肌纤维断裂等，造成穴区组织适度损伤。损伤组织可能释放损伤相关分子引起局部良性(有序且可控的)炎症反应，包括白细胞、肥大细胞浸润，释放血管活性物质如组胺、P物质和腺苷等，刺激神经，扩张局部血管，增强血液和淋巴循环[2]，启动穴区一系列化学信息变化，如免疫细胞募集、信号通路激活及化学物质释放，使得穴位微环境物理-化学耦合应答，通过级联放大引起后续生物学效应，激活穴区小网络，调节机体神经-内分泌-免疫大网络，产生针效[3]。因此，针刺所引起的局部微创可能是穴区及后续系统反应的源头。

2 损伤相关分子

当机体处于应激状态，或受到无菌性创伤和炎症刺激时，细胞内或细胞间质均能产生一类生物活性物质，使得免疫系统感到“危险”，进而引起机体的免疫应答[4]。这种能够使免疫系统感到“危险”进而发出警报的生物介质就是DAMPs，又可被称为“警报素”。DAMPs按来源可分为细胞外基质和细胞内产生两大类。一些细胞外基质在组织损伤后会通过蛋白质水解释放DAMPs，比如双糖链蛋白聚糖[5]、透明质酸[6]等。在应激和损伤环境中，不同种类的细胞内也会产生多种DAMPs，包括线粒体损伤后释放的mtDNA[7]、mROS[8]等，核内的高迁移率族蛋白(High Mobility Group Box 1，HMGB1)[9]、白介素-1α、白介素-33[10]、热休克蛋白[11]、S100[12]、三磷酸腺苷[13]及尿酸等。

近几年的研究中，人们逐渐认识到DAMPs对于人体内环境稳态十分重要，在机体中发挥着双刃剑的作用。一方面， DAMPs在细胞内清除病原体参与宿主防御和组织修复、调节DNA转录和维持钙平衡，在细胞增殖和分化等方面发挥重要作用。另一方面，机体活细胞受到生命威胁时，DAMPs作为一种危险信号会大量分泌及释放，加剧炎症和自身免疫应答，致使组织损伤，加剧感染程度，进而诱导无菌性过度炎症、败血症和脓毒症等危重病症[14]。

3 损伤相关分子参与针刺起效

3.1 针刺与HMGB1

在庞大的HMG蛋白家族中，HMGB1作为最丰富且研究最深入的蛋白分子，几乎能在所有真核生物的多种组织中广泛表达[15]，且在细胞内和细胞外都具有重要作用。起初人们认为HMGB1仅存在于细胞核中，是一种高度保守的染色质结构蛋白，可作为DNA分子伴侣，帮助维持核稳态和基因组稳定。后来Bustin M等[16]证明 HMGB1 存在于哺乳动物的细胞质中，其主要功能是调节细胞死亡，且已被证明是一种重要的促自噬蛋白，可提高细胞存活率并抑制程序性凋亡细胞死亡。HMGB1的主要结构是同源区域(称为A和B框)以及C端结构域，根据结构功能分析，HMGB1可具有促炎与抑炎双向作用，其促炎活性定位于B盒，而A盒因本身可以减弱B盒肽的促炎作用被认为具有抗炎活性，且在与酸性C尾端融合之后，抗炎活性会增强[17]。

HMGB1对生命体是不可或缺的，有文献表明HMGB1敲除新生小鼠会因染色体HMGB1缺乏导致致命的低血糖症[18]。细胞内HMGB1可以通过介导巨噬细胞自噬来保护小鼠免受内毒素血症和细菌感染的侵害[19]。近期有系列研究认为HMGB1在针刺的启动中可能发挥重要的作用。穴位是皮肤神经源性炎症点，针刺可引起穴区局部一系列的组织损伤，促进炎性介质如HMGB1、TLR4、TNF-α、IL-6和趋化因子的释放，随后激活细胞ERK、p38、JNK或NF-κB信号通路，触发启动穴位微环境时序性级联反应，进一步促进HMGB1的合成释放，形成一个正反馈循环，从而激活机体的先天和适应性免疫[20]，促进组织修复损伤。团队未发表的数据发现针刺可上调正常大鼠与佐剂性关节炎(Adjuvant-induced arthritis,AIA)大鼠穴区HMGB1蛋白，中和穴区HMGB1可降低针刺效应。研究证明电针可增强穴区HMGB1乙酰化程度，进而提高其活性及受体CD24表达，缓解慢性压迫性损伤大鼠的神经病理性疼痛[21]。以上研究均提示针刺可通过上调穴区HMGB1蛋白发挥针刺镇痛效应。

针刺同样对效应器官的HMGB1有调节作用，文献表明针刺可通过α7nAChR依赖性胆碱能信号抑制脑组织中HMGB1的释放[22]，发挥抗炎作用，对抵抗短暂性脑缺血性损伤有重大意义[23]。针对严重热损伤所致的急性肺损伤，电针ST36可显著降低肺组织中HMGB1蛋白含量，下调血浆中IL-1β、IL-6等炎性细胞因子水平并改善肺组织损伤，提示针刺在全身性炎症反应的治疗中颇具前景[24]。在治疗疼痛方面，也有文献显示电针可以提高神经病理性疼痛大鼠的痛阈值，改善痛觉行为反应，其机制可能与抑制海马区域HMGB1及其下游TNF-α、IL-1β等效应因子水平有关[25]。故当机体发生损伤、炎症和细胞死亡等情况时，HMGB1会从损伤细胞中释放，在效应器官发挥促炎效应，而针刺可下调效应器官HMGB1表达达到抗炎效应。

3.2 针刺与三磷酸腺苷

三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate，ATP)是一种核苷酸，不仅参与细胞的能量代谢、DNA复制和转录过程中聚合酶的核酸化过程，还作为一种信号分子作用于细胞膜的嘌呤受体，参与外周和中枢神经系统细胞外信号的传递以及细胞内信号的转导[26]。针效的产生离不开针刺的物理刺激在穴区局部组织转化为化学信息，沿复杂的神经-内分泌-免疫网络途径传导整合，到达效应器官发挥调节作用，而具有双重身份的ATP在针刺起效过程中发挥着重要的作用。2010年， 美国Goldman教授等在《Nature Neuroscience》中发表的1篇论文中提到：腺苷作为一种抗伤害作用的神经调节剂针刺后可在小鼠穴位局部释放，与腺苷A1受体(A1 Adenosine Receptors,A1Rs)结合，发挥镇痛效应[27]。后又有研究发现不同时间点针刺AIA大鼠，穴区ATP浓度变化趋势不同，且痛阈与穴区ATP浓度呈正相关，提示穴区局部ATP可能参与了针刺镇痛时间特征的外周响应[28]。而近几年有学者将微透析法和膜片钳技术结合，成功地实时检测到针刺过程中大鼠足三里穴位释放的ATP，为研究针刺信号的启动机制提供了一条新的途径[29]。笔者团队前期研究也表明针刺过程中足三里穴区腺苷物质明显上升，于行针30 min达到峰值。综上，针刺穴区局部ATP含量增加，ATP在被酶降解为一系列生物活性代谢物后，产生的腺苷可激活神经元腺苷A1受体的表达，在针刺镇痛中发挥积极作用。

3.3 针刺与热休克蛋白

热休克蛋白(Heat shock proteins，HSPs)是当机体处于高温、缺氧、创伤和缺血等情况下为保护机体细胞和组织免受伤害而合成的一组高度保守且功能多样的应激蛋白。HSP在病理条件下通过启动其他蛋白质折叠、修复，促进变性蛋白质的重新折叠以及不可修复蛋白质的降解等介导信号传导、细胞凋亡、炎症反应及氧化应激等病理生理过程，从而发挥细胞保护作用[30]。HSP家族分为高分子量和小分子量的HSP，高分子量HSP主要细胞功能是通过ATP依赖的变构组织来结合和折叠新生蛋白质；小分子HSP或热休克蛋白β(HspBs)是不依赖ATP的分子伴侣，在胚胎发育、心肌形成、肿瘤生物标志物形成以及蛋白质折叠中发挥重要作用[31]。

针刺作为一种机体的创伤刺激，在脑缺血[32]、心肌缺血再灌注[33]和抑郁症[34]等方面通过调节HSP分子来达到预防或者治疗的目的。杨永清教授发现正常大鼠针刺后穴区局部热休克蛋白、微管蛋白、血清白蛋白等参与免疫过程的蛋白显著上调[35]。同时在病理条件下电针可激活穴位局部的HSP，使其表达明显增加，改善内脏高敏感模型大鼠的痛阈[36]。对于患有阿尔茨海默症的SAMP8小鼠，针刺可通过减少氧化蛋白损伤并促进Hsp84和Hsp86表达来延缓其大脑衰老[37]。有文献表明，HSP70在多种疾病中发挥保护作用，针刺大多上调其表达。在急性胃黏膜损伤大鼠模型上，针刺可以使胃黏膜TGF-α和HSP70表达增强，且留针时间越长疗效越好，因此针刺能修复大鼠胃黏膜损伤可能与HSP70等内源性保护物质的合成有关[38]。由此可见，针刺大多增加穴区HSP的含量，但在效应器官会根据HSP分子本身对机体产生的积极或消极影响来上调或下调其表达，更好地发挥针刺疗效。

3.4 针刺与S100蛋白

在既往30年里，S100蛋白一直是广泛研究的对象，该蛋白家族可以通过充当细胞内Ca2+传感器和细胞外因子来调节细胞反应，当与Ca2+结合后，S100蛋白构象发生改变，暴露其与靶蛋白的结合位点，进而通过与相应的效应靶蛋白相互作用，发挥其在调节体内钙平衡、平滑肌收缩、细胞增殖和凋亡、炎症反应等生理和病理过程中重要的生物学功能[39]。研究发现电针通过降低认知功能障碍大鼠模型血清S-100β蛋白来减少脑损伤并促进神经再生[40]。在AIA小鼠中观察到脊髓周围的炎症生物标记物GFAP、S100B和RAGE的水平上调，电针则可以使这些炎症生物标志物表达下调，进而减轻AIA小鼠炎性疼痛，具有良好的镇痛效果[41]。S100A9被认为是炎症中最重要的氧化剂清除剂之一，有研究表明S100A9基因在哮喘早期气道反应阶段显著增加[42]，而针刺可下调S100A9基因表达3倍之多[43]。同时S100A9蛋白表达降低可以刺激ROS的产生和抑制p38MAPK磷酸化[44]，从而促进大鼠气道平滑肌细胞的增殖，这在哮喘气道重塑中起重要作用。因此，针刺大多作用于效应器官部位的S100蛋白，且通过下调其表达发挥治疗作用。

在针效启动和发展过程中，各DAMPs并不是一座座“孤岛”，而是相互之间紧密联系、协同合作。在针刺导致局部组织微损伤后，DAMPs(包括HMGB1、ATP及HSP等)由死细胞被动释放或应激细胞主动分泌，激活TLR和炎症小体[45]，创造促炎环境，募集所需细胞到达损伤部位，快速启动免疫反应，吞噬死亡细胞和细胞碎片等来清洁伤口，最终促进再生过程[46]。

4 小结

针刺起效的普适性作用原理是其作为一种微小创伤，可通过上调穴区HMGB1、ATP等DAMPs，参与针刺启动过程。而在效应器官部位针刺对DAMPs的调节作用则具有特殊性，对于发挥促炎活性的部分DAMPs可下调其表达，但一些发挥保护作用的DAMPs如HSP70、HSP84等可被针刺激活并在效应器官增加表达量，起到更好的治疗效果。因此，针刺虽然是一种损伤刺激，但其具有启动机体调节自稳态能力，而DAMPs作为针刺起效过程中的“前哨兵”，可被其双向调控，促进机体自我修复调节能力，恢复内环境稳态，达到更好的治疗效果。但目前关于针刺过程中DAMPs多为单一碎片化研究，与针刺引起的物理变化尚未建立起相互联系、相互影响的复杂网络概念，且物理-化学因素之间的耦合互作关系缺乏系统研究，有待于进一步探索。