Plackett-Burnman设计联合Box-Behnken设计-效应面法优化三颗针中盐酸小檗碱闪式提取工艺

冷怡林，金豆豆，李 娟

（洛阳市中医院 制剂室，河南 洛阳 471003）

三颗针为小檗科植物拟豪猪刺Berberis soulieana Schneid.、小黄连刺Berberis wilsonae Hemsl.、细叶小檗Berberis poiretii Schneid.或匙叶小檗Berberis vernae Schneid.等同属数种植物的干燥根。具有清热燥湿、泻火解毒的功效。用于湿热泻痢，黄疸，湿疹，咽痛目赤，聤耳流脓，痈肿疮毒。三颗针主要含异喹啉类生物碱[1]，具有抗病原微生物[2]，降低血压，提高免疫力，降脂调脂，抗心律失常、抗肿瘤等作用，临床用于消炎抗菌、降血压、降血糖、降血脂等[3-4]。其主要药效成分盐酸小檗碱具有广谱抗菌、增加白细胞吞噬功能、利胆、刺激促肾上腺皮质激素分泌及降压等作用，为临床常用抗菌消炎药[5]。

盐酸小檗碱的传统提取方法有石灰乳法[6-8]，酸水法[9]和醇提法[10]，但以上方法均不同程度地存在提取时间长、溶剂消耗大、有效成分提取率低、操作烦琐等问题。近年发展的闪式提取法是将药材与溶剂在室温下快速粉碎至细微颗粒，使溶剂迅速与药材组织内部结合并达到平衡的一种新技术，可最大限度地萃取有效成分，保护热敏成分，具有溶剂用量小、提取时间短、提取率高等优点[11-12]，广泛适用于中药有效成分的提取[13-14]。本实验首次将闪式提取法应用于三颗针中盐酸小檗碱的提取，通过Plackett-Burnman设计（PBD）筛选出提取过程中的主要影响因素，并利用最陡爬坡试验及Box-Behnken设计（BBD）-效应面（RSM）优化法，确定三颗针中盐酸小檗碱的最佳提取工艺和提取条件。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Thermo ScientificTMDionexTMUltiMateTM3000高效液相色谱仪（包括四元泵、DAD检测器，赛默飞世尔科技中国有限公司）；JHBE-50S型中药闪式提取器（河南金鼐科技发展有限公司）；H5322型中药粉碎机（河北朵麦信息科技有限公司）；Quintix 224电子天平（0.01 mg，德国赛多利斯公司）；PS-1010HT型数控超声波清洗器（功率600 W，合肥攀升超声波科技有限公司）；DHG-9053A型干燥箱（无锡玛瑞科技有限公司）；Milli-Q Academic超纯水系统（美国默克密理博）。

1.2 药品与试剂

盐酸小檗碱（批号：110713-202015，含量以85.9 %计，中国食品药品检定研究院）；三颗针药材购自安徽省亳州药材大市场，经鉴定为小檗科植物拟豪猪刺Berberis soulieana Schneid.的干燥根，除去杂质，洗净，干燥；乙腈，甲醇均为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 闪式提取工艺

取三颗针供试品适量，粉碎，过四号筛，取粉末约100 g，精密称定，投入闪式提取器中，加入适当提取介质，设置仪器参数，充分提取，过滤，取续滤液按相应方法测定，计算盐酸小檗碱的转移率。转移率（%）=提取液中盐酸小檗碱含量/药材中盐酸小檗碱含量×100。

2.2 盐酸小檗碱的含量测定

2.2.1 供试品溶液的制备 取三颗针供试品适量，粉碎，过四号筛，取粉末约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取盐酸小檗碱对照品适量，置于25 ml量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，制成每1 ml含盐酸小檗碱722.45 μg的对照品溶液，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，备用。

2.2.3 色谱条件 日本岛津Wondasil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液（24:76）；流速：1.0 ml/min；检测波长：265 nm；柱温30 ℃；进样量10.00 μl。在上述条件下，供试品溶液中盐酸小檗碱色谱峰理论塔板数高于6000，与相邻色谱峰分离度符合规定，见图1。

图1 三颗针盐酸小檗碱对照品溶液（A）和供试品溶液（B）HPLC图谱

2.2.4 线性关系考察 精密吸取对照品溶液 0.5，1，2，4，6，8 ml，分别置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，按2.2.3项下色谱条件测定，记录色谱图及盐酸小檗碱峰面积。以盐酸小檗碱质量浓度（x，μg/ml）为横坐标，以峰面积值（y）为纵坐标绘制标准曲线，并计算相应回归方程和相关系数（r）。结果盐酸小檗碱的回归方程为y=332 151x+1999.4（r=0.9994），表明峰面积与浓度在36.12～577.96 μg/ml范围内线性关系良好。

2.2.5 精密度试验 取对照品溶液，按2.2.3项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图及盐酸小檗碱峰面积。结果盐酸小檗碱峰面积RSD为0.58 %（n=6）。说明仪器精密度良好。

2.2.6 重复性试验 取三颗针样品6份，按2.2.1项下方法分别制备供试品溶液，按2.2.3项下色谱条件进样分析，记录色谱图及峰面积值。结果盐酸小檗碱平均含量为7.2245 mg/g，RSD为1.09 %（n=6）。表明方法重复性良好。

2.2.7 稳定性试验 取2.2.1项下供试品溶液，按2.2.3项下色谱条件，分别于制备后 0，4，8，16，20，24 h进样，记录色谱图及峰面积。结果盐酸小檗碱峰面积RSD为0.77 %（n=6）。说明供试品溶液在室温条件下24 h内稳定。

2.2.8 加样回收试验 取已知含量的三颗针样品9份，每份约0.5 g，精密称定，分成3组，分别精密加入浓度为1.452 mg/ml的盐酸小檗碱对照品溶液2.0，2.5，3.0 ml，按2.2.1项下供试品制备方法处理，按2.2.3项下色谱条件进样分析，记录色谱图。结果盐酸小檗碱的平均加样回收率为100.6 %，相应RSD值为2.15 %（n=9）。说明方法准确性良好。

2.3 PBD筛选显著性因素

2.3.1 PBD 因素水平及试验结果 参考文献报道[15-16]及前期研究，选择提取介质（乙醇）浓度、提取时间、液料比、药材粒度、提取次数、闪式提取器转速6个影响因素，以盐酸小檗碱转移率为响应值，每个因素设计2个水平（设计高水平为+1，低水平为-1），运用Design-Expert 8.0.6软件设置12组试验。PB试验因素及水平见表1，试验设计及结果见表2。

表1 Plackett-Burman试验设计因素及水平

表2 Plackett-Burman试验设计及结果

2.3.2 模型建立和分析 运用Design expert 8.0.6软件进行显著性分析，模型具有显著性（P＜0.05）；复相关系数R2=0.8955，相关性较好，说明可用该模型解释上述6个因素对响应值的影响，结果见表3。由表3可见，6个因素对响应值的影响按大小排序为液料比＞乙醇浓度＞提取时间＞闪式提取器转速＞提取次数＞药材粒度，影响闪式提取三颗针中盐酸小檗碱的显著性因素为液料比、乙醇浓度及提取时间。

表3 Plackett-Burman试验设计方差分析

2.4 最陡爬坡试验设计及结果

由PBD试验结果可知影响闪式提取三颗针中盐酸小檗碱的显著性因素为液料比、乙醇浓度及提取时间，且均呈正效应。为快速逼近最优区域，本研究设计最陡爬坡试验，固定提取次数为2次，药材粒度为30目，闪式提取器转速为3000 r/min，采用正向爬坡模式（液料比步长设为5 ml/g，乙醇浓度步长设为10 %，提取时间步长设为5 s），以盐酸小檗碱转移率为观察值，分析盐酸小檗碱提取的最优参数，结果见表4。由表4可知，最优提取工艺为实验4，参数为液料比40 ml/g，乙醇浓度70 %，提取时间30 s，此时盐酸小檗碱的转移率为96.57 %，因此选择实验3，4，5对应水平进行Box-Behnken设计-效应面优化试验。

表4 最陡爬坡试验设计及结果

2.5 BBD-RSM优化提取工艺

2.5.1 BBD试验因素、水平及结果 基于PBD试验及最陡爬坡试验结果，选择液料比（A），乙醇浓度（B），提取时间（C）为考察因素，以盐酸小檗碱的转移率为指标，采用Design expert 8.0.6软件，设置三因素三水平（编码为-1，0，+1）模型进行试验，并对二次多项方程进行显著性分析。因素与水平见表5，试验设计与结果见表6。

表5 Box-Behnken设计因素与水平

表6 响应面试验设计及结果

2.5.2 数据处理及模型拟合分析 运用Design expert 8.0.6软件，以盐酸小檗碱转移率（Y）为响应值对各因素进行多元线性回归、二项式拟合及方差分析。结果，模型显著（P＜0.05），失拟项不显著（P＞0.05），多元相关系数R2为0.9142，表明所建模型拟合度较高，能准确预测实际情况。回归方程为Y=96.42+2.41A+1.97B-0.32C+0.073AB-0.66AC+1.24BC-5.07A2-5.83B2-1.52C2，式中Y为盐酸小檗碱转移率，A、B、C分别为因素液料比、乙醇浓度、提取时间。回归模型方差分析结果见表7。

表7 BBD 试验结果方差分析

2.5.3 响应面分析与最佳工艺确定 由表7可知，因素液料比（A）与乙醇浓度（B）对盐酸小檗碱转移率有显著性影响，以液料比影响尤甚，影响程度大小依次为液料比＞乙醇浓度＞提取时间。为充分说明提取时间和液料比、提取时间和乙醇浓度、液料比和乙醇浓度交互作用对盐酸小檗碱转移率的影响，绘制响应面图和等高线，见图2。响应曲面较陡说明因素间交互作用显著，由图2可知，乙醇浓度与液料比对响应值的交互作用最显著。由Design expert 8.0.6软件分析确定三颗针中盐酸小檗碱闪式提取最佳因素取值为液料比为26.23 ml/g，乙醇浓度为71.60 %，提取时间为29.54 s，此条件下，盐酸小檗碱的转移率为96.88 %。为便于实验操作，将提取条件修正为液料比为25 ml/g，乙醇浓度为70 %，提取时间为30 s。

图2 三维响应面及等高线图

2.6 验证试验

为验证最佳闪式提取条件，取三颗针药材3份，按最佳提取工艺提取盐酸小檗碱，实际测得盐酸小檗碱的转移率为96.61 %，96.33 %，96.27 %，与预测值96.88 %的偏差为-0.78 %，-0.58 %，-0.64 %，表明该提取条件实测值与预测值差异很小[17]，说明最佳工艺模型准确可靠。

3 讨论

中药成分提取的影响因素主要有溶剂、温度、压力、药材粒度及液体的流动状态，常用中药提取方法有煎煮法、回流法、浸渍法、蒸馏法、渗漉法、连续回流法、破碎提取法等，但上述方法均不同程度地存在提取时间长，操作繁琐，提取率低等缺点。随着提取方法的不断改善和发展，闪式提取因提取快速高效、经济节能、操作方便、适用广泛、安全可靠等优势，得到广泛应用。

三颗针为小檗科植物，含小檗碱、小檗红碱、小檗胺、药根碱等化学成分，其主要成分盐酸小檗碱具有清热燥湿、泻火解毒的功效，用于治疗细菌性痢疾、胃肠炎、副伤寒等，疗效确切。因此本研究以盐酸小檗碱的转移率为指标，分析闪式提取三颗针的最优条件。

PBD相较于正交试验可实现以较少的实验次数快速准确地找到显著影响因素，减少工作量；最陡爬坡实验可快速逼近响应值的最优值区域；BBD-RSM弥补了正交试验和均匀设计等线性模型精密度低的不足，更好地揭示因素与响应值之间的关系，同时建立数据二项式模型，根据对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，被广泛应用于药材提取优化过程。

本试验利用Design expert 8.0.6软件，采用闪式提取法，以三颗针药材中盐酸小檗碱的转移率为响应值，首先通过Plackett-Burman试验设计筛选出3个显著性因素：液料比、提取时间和乙醇浓度；然后通过最陡爬坡实验，逼近响应值的最优区域，最后采用Box-Behnken设计-效应面分析优化得到最佳提取工艺为：液料比为25 ml/g，乙醇浓度为70 %，提取时间为30 s。并通过验证试验证明工艺快速可行且有效。