小儿咽扁颗粒多指标含量测定及化学计量学分析

曹春歌，房凌云

（山东省菏泽市中医医院 中药科，山东 菏泽 274000）

小儿咽扁颗粒是由金银花、射干、金果榄、玄参、桔梗、麦冬、人工牛黄和冰片八味药组成。方中金银花、射干共为君药，金银花甘寒入肺，清热解毒，主要活性成分为绿原酸、异绿原酸C和异绿原酸A[1-2]，射干宣散风热，祛痰利咽，主要活性成分为射干苷和次野鸢尾黄素异黄酮类成分[3]；金果榄性味苦寒，玄参苦咸微寒，桔梗开宣肺气，麦冬养阴润燥，四药相配，共奏滋阴宣肺，合为臣药，金果榄主要活性成分为二萜呋喃内酯型化合物古伦宾，玄参主要活性成分为哈巴苷及哈巴俄苷[4-7]；人工牛黄、冰片醒神开窍，共为佐药[8-9]。全方清热利咽，解毒止痛，临床用于小儿肺卫热盛所致的喉痹、乳蛾等症[10]。

小儿咽扁颗粒现行质量标准收载于《中国药典》2020年版一部，仅采用高效液相色谱（HPLC）法对绿原酸进行含量测定，仅涉及君药金银花所含的单一成分，并不能整体反映小儿咽扁颗粒的内在质量。现有文献[11-12]对小儿咽扁颗粒中的有效成分研究较少。本文采用HPLC对绿原酸、异绿原酸C、异绿原酸A、古伦宾、哈巴苷、哈巴俄苷、射干苷、次野鸢尾黄素8个指标成分进行含量测定，并建立指纹图谱结合化学计量学全面分析小儿咽扁颗粒的质量特性，为进一步的临床研究提供理论依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪（DAD检测器，美国安捷伦公司）；XS205型电子天平（d=0.01 mg，瑞士梅特勒托利公司）；KQ-500DBG型数控超声波清洗器（昆山超声波仪器有限公司）；QYSW-30A型超纯水仪（美国Millipore公司）。

1.2 试药

绿原酸（批号：110753-202018，纯度：96.1 %），古伦宾（批号：111837-201703，纯度：99.8 %），哈巴苷（批号：111729-201707，纯度：96.8 %），哈巴俄苷（批号：111730-201709，纯度：95.9 %），射干苷（批号：111632-202003，纯度：98.7 %），次野鸢尾黄素（批号：111557-201703，纯度：99.9 %，中国食品药品检定研究院）；异绿原酸C（批号：20201125），异绿原酸A（批号：20210117，四川省维克奇生物科技有限公司，含量均≥98.6 %），甲醇，乙腈均为色谱纯（美国Merck公司），其他试剂均为分析纯，水为超纯水。

市售小儿咽扁颗粒共计3个生产厂家12个批次，见表1。

表1 小儿咽扁颗粒样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件[13-15]

色谱柱为Waters XTERRA C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.3 % 磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～13 min，12 %A；13～27 min，12 %→45 %A；27～37 min，45 %→55 %A；37～50 min，55 %→78 %A）；检测波长：220 nm（0～13 min，检测哈巴苷；27～50 min，检测古伦宾、哈巴俄苷、射干苷、次野鸢尾黄素）；326 nm（13～27 min，检测绿原酸、异绿原酸C、异绿原酸A）；流速为1.0 ml/min；柱温为35 ℃；进样量为10 μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 精密称取绿原酸、异绿原酸C、异绿原酸A、古伦宾、哈巴苷、哈巴俄苷、射干苷、次野鸢尾黄素对照品各适量，加甲醇，超声使溶解，配制成每1 ml含绿原酸399.5 μg、异绿原酸C 143.1 μg、异绿原酸A 140.6 μg、古伦宾72.72 μg、哈巴苷0.3561 mg、哈巴俄苷149.7 μg、射干苷71.64 μg、次野鸢尾黄素95.36 μg的混合对照品储备液，精密量取对照品储备液2 ml，置20 ml棕色量瓶中，用甲醇稀释至刻度，室温避光保存，备用。

2.2.2 供试品溶液的制备 取小儿咽扁颗粒10袋，取内容物，研磨均匀，精密称取2.0 g，置50 ml棕色量瓶中，加入85 %甲醇约40 ml，室温超声处理（功率400 W，频率40 kHz）45 min，放冷，用85 %甲醇定容至刻度，摇匀，经0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 按小儿咽扁颗粒的制备工艺分别制备缺金银花、射干、玄参和金果榄的阴性样品，按2.2.2项下方法制备阴性对照溶液，即得。

2.3 HPLC指纹图谱建立

2.3.1 精密度试验 取小儿咽扁颗粒样品（编号：S6），按2.2.2项下方法制成供试品溶液，连续进样测定6次，以4号峰（绿原酸）为参照峰，测得其余16个共有峰相对保留时间及相对峰面积RSD（n=6）均分别小于0.97 %和1.64 %，表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验 取同一份小儿咽扁颗粒（编号：S6）供试品溶液，分别于0，5，10，15，20，24，36 h，按2.1项色谱条件进样测定，以4号峰（绿原酸）为参照峰，测得其余16个共有峰相对保留时间及相对峰面积RSD（n=7）分别小于1.03 %和2.16 %，表明小儿咽扁颗粒供试品溶液36 h内稳定。2.3.3 重复性试验 取小儿咽扁颗粒样品（编号：S6）6份，分别按2.2.2项下方法制成供试品溶液，按2.1项色谱条件进样测定，以4号峰（绿原酸）为参照峰，测得其余16个共有峰相对保留时间及相对峰面积RSD（n=6）分别小于1.49 %和2.79 %，表明该方法重复性良好。

2.3.4 指纹图谱的建立及相似度评价 取12批小儿咽扁颗粒样品各适量，按2.2.2项下方法制成供试品溶液，依法进样测定，将色谱图数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012A版），以编号S6色谱图为参考图谱，时间窗宽度设为0.1 min，多点校正生成对照指纹图谱，色谱图见图1。共标示出17个共有峰，其中4号峰（绿原酸）色谱峰响应值最大，稳定性好，故选择4号峰（绿原酸）作为参照峰（S），计算12批小儿咽扁颗粒样品的指纹图谱相似度分别为0.990，0.991，0.988，0.987，0.992，0.984，0.993，0.985，0.996，0.995，0.986，0.997，均大于0.95，表明小儿咽扁颗粒质量总体较稳定。

图1 12批小儿咽扁颗粒HPLC指纹图谱（S1～S12）和对照指纹图谱（R）

2.3.5 主要特征峰归属 精密吸取2.2.1项下8个成分对照品溶液，依法进样测定，记录色谱图，与指纹图谱各主要共有峰进行对比，确认其中8个色谱峰，分别为2号峰哈巴苷、4号峰绿原酸、7号峰异绿原酸C、10号峰异绿原酸A、12号峰射干苷、15号峰古伦宾、16号峰次野鸢尾黄素和17号峰哈巴俄苷。

2.4 多指标成分含量测定

2.4.1 系统适用性试验 分别精密吸取2.2项下混合对照品溶液、供试品溶液和各阴性供试品溶液各10 μl，按2.1项下色谱条件参数，结果各待测成分分离度均大于1.5，理论塔板数以绿原酸峰计大于5500。阴性供试品溶液中的其他成分对8种有效成分的测定无干扰，说明该色谱系统专属性较好。色谱图见图2。

图2 HPLC图谱

2.4.2 线性关系考察 分别精密吸取2.2.1项下混合对照品储备液1.0，3.0，5.0，6.0，7.0，9.0 ml，置于同一50 ml量瓶中，加甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，得系列混合对照品溶液，精密吸取上述系列混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件进样，记录色谱图。以质量浓度为横坐标（X，μg/ml），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，绘制各组分标准曲线，计算回归方程和相关系数。结果表明：绿原酸、异绿原酸C、异绿原酸A、古伦宾、哈巴苷、哈巴俄苷、射干苷及次野鸢尾黄素在试验范围内呈良好的线性关系。将对照品溶液逐级稀释后，以信噪比（S/N）约为10.0时的浓度为各成分的定量限（LOQ）。结果见表2。

表2 线性关系考察结果

2.4.3 精密度试验 精密吸取2.2.1项下混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件，连续进样6次，记录峰面积。结果：绿原酸、异绿原酸C、异绿原酸A、古伦宾、哈巴苷、哈巴俄苷、射干苷、次野鸢尾黄素峰面积的RSD分别0.54 %，0.73 %，0.79 %，0.84 %，0.66 %，0.62 %，0.89 %，0.91 %（n=6），表明仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性试验 取同一供试品（S6）溶液，分别于制备后0，5，10，15，20，24 h，按2.1项下色谱条件进样测定。结果：绿原酸、异绿原酸C、异绿原酸A、古伦宾、哈巴苷、哈巴俄苷、射干苷、次野鸢尾黄素峰面积的RSD（n=6）分别为0.77 %，0.89 %，0.91 %，1.03 %，0.95 %，1.11 %，0.97 %，0.84 %（n=6），表明供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.4.5 重复性试验 取同一批小儿咽扁颗粒样品（S6），按2.2.2项下方法制备供试品溶液，共6份，按2.1项下色谱条件进样测定，计算小儿咽扁颗粒中8个成分含量及其RSD值。结果：绿原酸、异绿原酸C、异绿原酸A、古伦宾、哈巴苷、哈巴俄苷、射干苷、次野鸢尾黄素含量的平均值分别为0.2853，0.1022，0.1004，0.0606，0.1069，0.0618，0.0597，0.0745 mg/g，RSD（n=6）分别0.93 %，1.04 %，1.07 %，1.12 %，0.85 %，0.88 %，0.95 %，1.19 %（n=6），表明方法重复性良好。

2.4.6 加样回收试验 取同一批（S6）小儿咽扁颗粒6份，每份1.0 g，精密称定，分别加入2.2.1项下混合对照品储备液1.0 ml，按2.2.2项下方法处理，再按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图，计算各成分加样回收率及其RSD值，结果见表3。

表3 （续）

表3 8个成分的加样回收试验结果（n=6）

2.4.7 样品测定 取小儿咽扁颗粒12批，按2.2.2项下方法，平行制备3份供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录绿原酸、异绿原酸C、异绿原酸A、古伦宾、哈巴苷、哈巴俄苷、射干苷、次野鸢尾黄素的峰面积，采用外标法计算小儿咽扁颗粒中上述8个成分含量。结果见表4。

表4 小儿咽扁颗粒中8个成分含量测定结果（n=3）

2.5 化学模式识别分析

2.5.1 聚类分析 以12批小儿咽扁颗粒8个成分含量测定结果为变量，运用SPSS 26.0软件，采用“组间连接”，“平方欧式距离”进行聚类分析[16]。根据聚类分析树状图（图3），当类间距离为10时，12批样品可分为2大类，一家企业（贵州神奇制药）聚为一类，另外两家企业（四川禾邦阳光制药和陕西盘龙制药）聚为一类，当类间距离为5时，12批样品又各自聚为一类，可分成3类。说明同一厂家不同批次的产品具有较高相似度，但不同厂家的样品具有差异性。

图3 12批小儿咽扁颗粒聚类分析树状图

2.5.2 正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA） 为更具体地研究造成不同厂家不同批次小儿咽扁颗粒组间差异的化学成分，将12批小儿咽扁颗粒的17个共有峰的峰面积导入SIMCA-P 14.1软件，启动OPLS-DA分析程序并建立有监督模式的OPLSDA模型[17]，见图4。由图4可见，12批小儿咽扁颗粒的分类情况与上述聚类分析一致，且模型的预测能力和稳定性都较高（Q2=0.947，R2Y=0.899，R2X=0.856），说明所建立的OPLS-DA模型可判别不同厂家的小儿咽扁颗粒。同时用OPLS-DA中变量重要性投影值（VIP）筛选差异性质量标志物，在95 %的置信区间内且VIP大于1，说明该变量对整体模型的贡献度高于平均水平，对产品质量影响具有统计学意义，可能为小儿咽扁颗粒的差异性质量标志物。由图5可知，区分小儿咽扁颗粒的质量差异标志物可能是绿原酸、古伦宾、射干苷和次野鸢尾黄素（这4种成分VIP＞1）。生产企业在质量监控过程中可重点关注这4个成分的含量变化，科学合理地提高该制剂稳定性。

图4 12批小儿咽扁颗粒的OPLS-DA分析得分图

图5 小儿咽扁颗粒的变量载荷评价参数（VIP）

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

采用DAD检测器在190～400 nm波长范围内对小儿咽扁颗粒中8个化合物进行了扫描，结果绿原酸、异绿原酸C、异绿原酸A在326 nm处有最大吸收；古伦宾、哈巴苷、哈巴俄苷、射干苷、次野鸢尾黄素在220 nm处有最大吸收，故选用分段切换波长法检测。在流动相的选择中，分别考察了甲醇、乙腈作为有机相，水、不同比例磷酸溶液（0.1 %，0.3 %，0.5 %），冰醋酸溶液（0.1 %，0.3 %，0.5 %）作为水相的多种流动相系统，结果以乙腈-0.3 %磷酸水溶液溶液为流动相，绿原酸、异绿原酸C、异绿原酸A、古伦宾、哈巴苷、哈巴俄苷、射干苷、次野鸢尾黄素8个成分的色谱峰峰形及分离度较好。

3.2 耐用性考察

本研究考察了不同色谱柱[Waters XTERRA C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、SHIMADZU VP-ODS（250 mm×4.6mm，5μm）及Thermo Hypersil Gold C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]，不同流速（0.8，1.0，1.2 ml/min），不同柱温（25，30，35 ℃）等对小儿咽扁颗粒中8个成分含量测定结果的影响，结果发现这些色谱条件的变化对各成分含量测定结果影响不大，说明本方法具有较好的耐受性。

3.3 结果分析

12批小儿咽扁颗粒指纹图谱相似度大于0.95，表明小儿咽扁颗粒化学成分一致性较好；含量测定结果表明不同生产企业产品中8个指标成分的含量存在一定差异，编号S1～S3的小儿咽扁颗粒（生产年份为2019年）中8个成分的含量普遍偏低，可能与样品生产时间较长有关；正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）得出绿原酸、古伦宾、射干苷和次野鸢尾黄素可能是小儿咽扁颗粒的质量差异标志物，建议企业加强对金银花、金果榄和射干药材的监控，参照《中国药典》2020年版规定的限量值制定内控指标，从药材源头和制剂生产过程中把控产品质量，以达到临床用药的稳定。

4 结论

本研究建立了一种可同时测定小儿咽扁颗粒中绿原酸、异绿原酸C、异绿原酸A、古伦宾、哈巴苷、哈巴俄苷、射干苷、次野鸢尾黄素8个化学成分的HPLC法，方法准确稳定、操作简便、重复性高，可用于小儿咽扁颗粒的质量控制，并结合化学计量学分析进行综合质量评价，为完善其质量标准提供实验依据。