河南省濮阳市犊牛腹泻大肠杆菌分离鉴定及生物学特性分析

赵朋宽

（南乐县农业农村局，河南南乐 457400）

犊牛腹泻是危害养牛业的主要疾病之一，临床中尤以细菌性腹泻最为常见，如大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、奇异变形杆菌等引起的腹泻，其中沙门氏菌和大肠杆菌危害最严重[1-3]。犊牛大肠杆菌病由不同血清型的致病性大肠杆菌引起，临床以腹泻、脱水、消瘦为主，呈地方性或散发性流行，10 日龄以内犊牛最易感，发病率和死亡率均较高，严重影响牛养殖业健康发展[4-6]。相关研究[7-8]表明，大肠杆菌抗原结构复杂，具有多种致病性血清型且无交叉保护性，无有效疫苗预防其感染，导致大肠杆菌病广泛发生与流行。细菌生物被膜（bacterial biofilm，BBF）是组成结构性细菌群落的主要物质，其形成能力与细菌毒力及耐药性具有一定相关性[9]。当前，犊牛大肠杆菌病主要用抗生素进行治疗，而抗生素的滥用，致使大肠杆菌耐药性增强，且出现了多重耐药菌株，因而加大了该病的治疗难度，同时大肠杆菌的耐药性和药物残留问题也威胁着人类健康[10-11]。

本试验采集243 份腹泻犊牛的肛拭子、粪便、肝脏等病料样品进行大肠杆菌分离鉴定，然后对致病性大肠杆菌进行致病性、血清型、生物被膜形成能力及耐药性等相关生物学特性检测，以期为该地区犊牛大肠杆菌性腹泻防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

从2018—2020 年采集的243 份腹泻犊牛肛拭子、粪便、肝脏等病料样品中进行大肠杆菌分离鉴定，其中肛拭子样品96 份、粪便样品86 份、肝脏样品61 份。

1.2 主要材料

麦康凯培养基、96 孔细菌培养板、大肠杆菌显色培养基、营养肉汤，购自北京双旋微生物培养基制备科技公司；药物纸片，购自杭州天和微生物制剂有限公司；细菌生化试纸条，购自上海研晶生物科技有限公司；大肠杆菌O 抗原鉴定因子，购自中国兽医药品监察所；460 只体质量（25±2）g的昆明系小白鼠，购自北京维通利华实验动物有限公司。

1.3 细菌分离与培养

对腹泻犊牛样品处理后，无菌接种于麦康凯培养基进行鉴别培养；37 ℃恒温培养18～24 h 后，挑取单个菌落接种于大肠杆菌显色培养基；37 ℃培养12～18 h，再挑取单个菌落接种于营养肉汤纯化培养，然后进行镜检和生化试验。

1.4 致病性试验

参考文献[12]的方法，将分离菌株接种于营养肉汤中，200 r/min 37 ℃震荡培养2～4 h 至对数期，用平板计数法进行菌落计数；调整菌液浓度为107cfu/mL，每株分离菌株灌服4 只昆明系小鼠，剂量为0.25 mL，对照组给予等量的无菌生理盐水。试验期为7 d，试验期间观察小鼠发病情况，对死亡小鼠进行细菌分离鉴定。

1.5 细菌血清型检测

参考文献[7]方法，将分离菌株接种于普通营养琼脂培养斜面上，37 ℃培养12 h 后取出，在无菌条件下用无菌生理盐水洗脱灭菌管，121 ℃灭菌3 h，破坏分离菌株K 抗原、O 抗原鉴定因子后进行玻板凝集试验，用5%石碳酸作对照，对分离菌株进行血清型检测。

1.6 细菌生物被膜形成能力检测

参考文献[13]方法，在96 孔细菌培养板，加入190 μL 普通营养肉汤，然后接种10 μL 菌液，对照孔加200 μL 营养肉汤，37 ℃培养18 h；用PBS 洗涤3 次，用甲醛固定20 min；加入结晶紫染色5 min，PBS 洗涤烘干；每孔加入200 μL 95%乙醇洗脱30 min，用酶标仪测OD600，对分离菌株进行被膜形成能力测定。判定标准以阴性对照孔OD 的2 倍作为判断能否形成被膜的临界点ODc。当OD=ODc 时，表示被膜形成能力为0；当OD ＜ODc 时，表示被膜形成能力较弱；当ODc ＜OD ≤2ODc 时，表示被膜形成能力中等；当OD ≥2ODc 时，表示被膜形成能力较强。

1.7 药敏试验

参照美国临床实验室标准化协会（CLSI）2013 年推荐的标准药敏试验法[14]进行操作和试验结果判断。将分离菌株培养至对数期，调整菌液浓度为107cfu/mL，无菌条件下取100 μL 菌液均匀涂布在90 mm普通营养琼脂培养基中，贴上药敏纸片，每种药做3 个重复；37 ℃培养18 h 后，测定抑菌圈直径，取平均值。药物敏感性标准见表1。

表1 常用药物的药敏试验判定标准

2 结果

2.1 细菌分离培养

经麦康凯培养基、大肠杆菌显色培养基培养及镜检，从采集的243 份样品中分离到113 株符合大肠杆菌培养特性和形态学的细菌。

2.2 细菌生化试验

参照细菌生化试纸条说明书，对分离的疑似大肠杆菌菌株进行生化试验，结果分离的113 株细菌全部被鉴定为大肠杆菌，大肠杆菌平均分离率为46.5%（113/243），其中肛拭子样品的分离率为43.8%，粪便样品为45.3%，肝脏样品为52.5%（表2）。

表2 不同病料样品中的大肠杆菌分离情况

2.3 致病性试验

攻毒组小鼠在攻毒后2～4 d 出现发病情况，个别小鼠出现急性死亡。剖检死亡小鼠发现，肠道出血，肠黏膜脱落，肝、脾出现不同程度出血，且均分离到大肠杆菌，而对照组小鼠健康存活。经统计，引起小鼠发病的有9 株大肠杆菌，引起死亡的有78 株（表3），表明引起小鼠发病和死亡的87株大肠杆菌为致病性大肠杆菌。

表3 大肠杆菌致病性试验结果

2.4 血清型检测

用玻板凝集试验对分离的87 株致病性大肠杆菌进行血清鉴定。结果（表4）显示：分离的致病性大肠杆菌分属于14 种血清型，分布在不同样品中，其中O101（18.4%）、O38（17.2%）和O142（14.9%）型占比较高，为该地区致犊牛腹泻的优势血清型。

表4 分离的致病性大肠杆菌血清型分布

2.5 生物被膜形成能力检测

分离的87 株犊牛源致泻性大肠杆菌中，膜形成能力较强的24株（26.6%），中等的34株（43.6%），较弱的17株（19.5%），不形成被膜的12株（15.4%），不同生物被膜形成能力的菌株分布在不同血清型中（表5）。

表5 分离的致病性大肠杆菌血清型和生物被膜形成能力相关性分析结果

2.6 药敏试验

药敏试验结果（表6）显示：分离的87 株致病性大肠杆菌对阿莫西林、氨苄西林、链霉素等6种药物的耐药率较高，为77.0%～98.9%，其次是对新霉素、庆大霉素、大观霉素等4 种药物，耐药率为49.4%～52.9%；对头孢噻呋、头孢噻肟、氟苯尼考等7 种药物的耐药率较低，为9.2%～26.4%。

表6 药敏试验结果

3 讨论

国内外研究[15-16]表明，大肠杆菌是引起犊牛腹泻的主要的病原菌之一，引起的发病率和死亡率较高，对犊牛危害较大，严重影响养牛业发展。大肠杆菌为条件性致病菌，广泛存在于环境中，尤其是卫生较差的牛舍，当发生冷热等外在因素应激时，机体抵抗力下降，继而引起大肠杆菌病，因此，注意环境卫生及环境消毒也是有效防控大肠杆菌病的重要措施。致病性大肠杆菌在我国广泛分布，因此应做好控制，降低该疾病发病率[17-18]。本研究从濮阳市243 份腹泻犊牛病料中分离到87 株致病性大肠杆菌，分离率为35.8%，说明致病性大肠杆菌可能在该地呈地方性流行。大肠杆菌血清型多样化，同一宿主不同地区，其优势血清型分布也存在一定差异。吴孟等[19]报道，巴州地区犊牛腹泻大肠杆菌血清型以O78、O111 为主；史量全等[20]报道，内蒙古地区犊牛腹泻大肠杆菌血清型主要为O132 型；高海慧等[11]报道，宁夏地区犊牛腹泻大肠杆菌的优势血清型是O20 和O26。而本研究发现，濮阳市犊牛致病性大肠杆菌优势血清型为O38（17.2%）、O101（18.4%）和O142（14.9%）。因此，各地应根据当地的优势血清型研制相应血清型的疫苗，如濮阳市可以研制O38、O101 和O142血清型多价疫苗。本研究为研制该地区犊牛腹泻性大肠杆菌疫苗提供了参考。

研究[8-9]表明，细菌生物被膜可以抵抗外界不利环境因素，其形成是细菌的一种自我保护机制。本研究发现，分离的87 株致病性大肠杆菌中，膜形成能力强的 24 株，中等的34 株，占66.7%。张召兴等[13]报道，河北省蛋鸡源大肠杆菌具有生物被膜形成能力；麻海澜等[18]报道，内蒙古地区犊牛源大肠杆菌具有生物被膜形成能力。综合上述报道与本研究结果，说明各地的致病性大肠杆菌外界生存能力均较强。因此，在养殖过程中，对于环境消毒，可考虑不同种类消毒药交替使用，以减少环境中大肠杆菌对消毒药的耐药性。

在临床防治大肠杆菌病过程中，不合理使用抗菌药物现象较多，导致大肠杆菌出现较强的耐药性，且耐药性在不同菌株之间传播，导致大肠杆菌耐药性加重[4-5]。麻海澜等[18]报道，内蒙古地区分离的51 株犊牛源大肠杆菌对甲氧苄啶、磺胺嘧啶、氨苄西林等20 种药物产生耐药性；高海慧等[11]报道，宁夏地区犊牛腹泻大肠杆菌的耐药率高，多重耐药普遍，耐药现象严重；石凯元等[21]报道，湘西北地区某肉牛养殖场犊牛腹泻性大肠杆菌对22种药物产生了耐药性。本研究发现，分离的87 株致病性大肠杆菌对阿莫西林、氨苄西林、链霉素等10 种药物的耐药率较高，均在49.4%以上。上述研究结果说明，犊牛腹泻性大肠杆菌耐药性普遍，应该引起重视。不同地区的大肠杆菌耐药谱并不相同，这可能与不同地区使用的抗生素种类不同有关。因此，在临床治疗犊牛腹泻大肠杆菌病过程中应注意抗生素的合理使用，结合药敏试验科学用药。