银杏叶提取物对球囊损伤后大鼠颈动脉内膜增生致再狭窄的影响

徐鹏，马珂，岳永强

（郑州大学第一附属医院腔内血管外科，河南 郑州 450000）

颈动脉狭窄是临床常见的血管类疾病，多发于60 岁以上人群，以发病率高、并发症多为主要特征，可诱发脑部缺血、局部神经功能一过性丧失，严重时可引发缺血性脑卒中，危及患者生命[1]。颈动脉支架成形术（carotidarterystenting,CAS）是颈动脉狭窄最常用的治疗手段，可有效提升血流通畅度，维持大脑血液循环，但其术后易发生血管再狭窄，大大提高了致残率及病死率[2]。近年来随着药物洗脱支架、激光内照射等新兴技术的应用，一定程度上降低了CAS 术后短期再狭窄率，但其安全性及远期预后仍未得到验证，依然是临床医生面临的重大难题之一。银杏叶提取物是自中药银杏叶中提取的混合物，具有抗氧化、抗炎、抗血小板及神经保护等药理作用[3]。近年来有学者认为[4]，银杏叶提取物可减少小鼠主动脉瓣组织钙沉积，降低其钙含量，从而减轻华法林诱导的主动脉瓣钙化。然而，目前关于其对CAS 术后再狭窄的缓解作用鲜有报道，且缺乏对应的机制研究。大鼠颈总动脉球囊损伤模型是模拟CAS 术后再狭窄的经典模型，本研究通过建立该模型，观察银杏叶提取物对球囊损伤后大鼠颈动脉再狭窄的影响，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

50 只SD 大鼠，SPF 级，雄性，8 周龄，体质量（300±20）g，上海吉辉实验动物饲养有限公司，生产许可证号SCXK（沪）2017-0012。

1.2 药物、主要试剂、仪器

银杏叶提取物（质量分数98%）、核转录因子-κB（NF-κB）信号通路激活剂佛波酯（上海沪峥生物科技有限公司）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、一氧化氮（NO）试剂盒（上海研生实业有限公司）；兔抗大鼠增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）、NF-κB p65、p-NF-κB p65、胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）、p-ERK1/2 一抗[艾比玛特医药科技（上海）有限公司]。GENios 酶标仪（瑞士Tecan 公司）；SZ2 显微镜（日本Nikon株式会社）。

1.3 颈总动脉球囊损伤模型的建立[5]

大鼠适应性饲养1 周后开始复制模型，禁食禁水12 h，背部皮下注射低分子肝素预防急性血栓，12 h 后腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，仰卧位固定于手术台，备皮消毒后沿颈部正中线切开皮肤，分离左颈主动脉、颈外动脉及颈内动脉，动脉夹夹闭主动脉近心端及颈内动脉，结扎颈外动脉远心端，并于近心端做剪口，将2F球囊导管由剪口处插入颈动脉3 cm，球囊给压4ATM，缓慢泄压抽动导管，重复3次后撤出球囊，动脉夹撤出，观察到颈主动脉、颈内动脉恢复搏动则表明模型复制成功，后封闭切口。术后24 h 皮下注射低分子肝素，腹腔注射15 万u/kg青霉素防止感染，每日1次，连续3 d。

1.4 干预方式[6-7]

40 只大鼠复制模型，剔除中途死亡10 只，成功30 只，随机数字法分为模型组、银杏叶组、银杏叶+佛波酯组，每组各10 只。另取10 只大鼠仅仅分离左颈外动脉并结扎，设为假手术组。银杏叶+佛波酯组灌胃银杏叶提取物生理盐水溶液（含银杏叶提取物100 mg/kg），2 h 后皮下注射佛波酯（1 μg/只）；银杏叶组灌胃银杏叶提取物生理盐水溶液（含银杏叶提取物100 mg/kg），皮下注射等量生理盐水；假手术组、模型组灌胃等量生理盐水，皮下注射等量生理盐水。每日1 次，干预14 d。干预期间测量体质量并观察大鼠饮水、精神状态及毛发等一般情况。

1.5 组织取材

末次干预次日，戊巴比妥钠麻醉大鼠，采集腹主动脉血，低温离心机分离出血清，置于4 ℃冰箱冷藏保存；取血后脊椎脱臼处死大鼠，剥离左颈动脉，切取球囊损伤段，分成2份，一份投入4%（φ）多聚甲醛中固定24 h，经脱水、透明、浸蜡、包埋，病理切片机切为4 μm 厚度切片用于免疫组化染色及HE 染色，另一份置于-80 ℃冰箱冷冻保存，用于组织蛋白检测。

1.6 检测血清炎症因子水平

取冷藏保存的腹主动脉血清，经ELISA 法检测血清炎症因子TNF-α、IL-6 水平，按照试剂盒说明书要求操作实验步骤，经酶标仪测定波长570 nm位置吸光度（A）值，绘出标准曲线计算TNF-α、IL-6浓度。

1.7 检测血清MCP-1、NO水平

取冷藏保存的腹主动脉血清，经ELISA 法检测血清MCP-1、NO 水平，按照试剂盒说明书要求操作实验步骤，经酶标仪测定波长450 nm 位置吸光度（A）值，绘出标准曲线计算MCP-1、NO浓度。

1.8 免疫组化法检测颈动脉血管PCNA阳性表达

取颈主动脉组织切片，脱蜡至水后滴加柠檬酸盐缓冲液，微波加热修复抗原，冷却后PBS 冲洗，滴加3%H2O2避光保存20 min，PBS 冲洗，加入山羊血清常温孵育20 min，吸弃血清，加入兔抗大鼠PCNA一抗（1∶300），移至黑暗湿盒内冰箱冷藏过夜，PBS冲洗，加入二抗，37 ℃孵育1 h，PBS 冲洗后滴加DAB 显色液，蒸馏水冲洗后，滴入中性树胶封片，置于显微镜下观察PCNA 阳性表达。棕色细胞即为PCNA 阳性细胞，计算阳性细胞率=棕色细胞数/总细胞总数×100%。随机选取5 个不相邻均匀视野计数，取其均值。

1.9 HE染色观察颈总动脉内膜增生及管腔狭窄程度

取颈主动脉组织切片，脱蜡至水后，蒸馏水冲洗，投至苏木素溶液染色5 min，蒸馏水冲洗，滴加1%盐酸酒精分化，碳酸氢钠溶液漂洗，伊红液二次染色2 min，常规脱水、透明后，中性树脂封片，光镜下观察颈总动脉组织横切面病理变化并拍照记录，经Image J 软件测量外膜内区、内膜内区及管腔面积，计算内膜增生率=（内膜内区面积-管腔面积）/（外膜内区面积-内膜内区面积）×100%，管腔狭窄指数=管腔面积/内膜内区面积。

1.10 Western blot法检测颈总动脉组织NF-κB p65、p-NF-κB p65、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达

取冷冻保存的颈总动脉组织，剪碎后放入研磨器充分研磨，PBS匀浆，加入预冷RIPA裂解液，注入离心管内，低温离心10 min（10 000 r/min，r=15 cm），取其上清，BCA 法测定总蛋白并定量。取40 μg 待测样本，混合5×SDS 上样缓冲液，金属浴沸腾变性蛋白，电泳分离后转至PVDF 膜，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，加入兔抗大鼠NF-κB p65、p-NF-κB p65、ERK1/2、p-ERK1/2 一抗（1∶500），4 ℃冰箱冷藏过夜，TBST 洗膜，加入二抗，室温孵育2 h，TBST 洗膜，混合ECL 发光液，曝光、显影，经成像分析仪扫描并分析蛋白条带灰度值，以GAPDH 为内参蛋白，分析NF-κB p65、p-NF-κB p65、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白相对表达水平，并计算p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-ERK1/2/ERK1/2。

1.11 统计学方法

采用SPSS 25.0 统计软件，计量资料以表示，多样本资料比较采用单因素方差分析，LSD-t进行两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况

假手术组大鼠体质量稳定，饮水量正常，精神佳且毛发光亮；模型组大鼠体质量明显降低，饮水量减少，精神不佳且毛发杂乱无光；银杏叶+佛波酯组大鼠体质量降低，饮水量正常，精神一般，毛发整齐暗淡，银杏叶组大鼠一般情况较银杏叶+佛波酯组改善更佳。

2.2 大鼠血清TNF-α、IL-6水平

与假手术组比较，模型组大鼠血清TNF-α、IL-6水平升高（P<0.05）；与模型组比较，银杏叶组大鼠血清TNF-α、IL-6水平降低（P<0.05）；与银杏叶组比较，银杏叶+佛波酯组大鼠血清TNF-α、IL-6 水平升高（P<0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血清TNF-α、IL-6水平比较Table 1 Comparison of serum TNF-α and IL-6 levels of rats in each group(±s,n=10)ρ/（ng·L-1）

表1 各组大鼠血清TNF-α、IL-6水平比较Table 1 Comparison of serum TNF-α and IL-6 levels of rats in each group(±s,n=10)ρ/（ng·L-1）

与假手术组比较：*P<0.05；与模型组比较：#P<0.05；与银杏叶组比较：@P<0.05。

组别假手术组模型组银杏叶组银杏叶+佛波酯组TNF-α 66.77±8.01 223.56±23.35*94.04±11.06#147.61±12.77@IL-6 54.42±6.38 168.46±18.17*73.76±8.06#131.26±17.27@

2.3 大鼠血清MCP-1、NO水平

与假手术组比较，模型组大鼠血清MCP-1 水平升高，NO 水平降低（P<0.05）；与模型组比较，银杏叶组大鼠血清MCP-1 水平降低，NO 水平升高（P<0.05）；与银杏叶组比较，银杏叶+佛波酯组大鼠血清MCP-1水平升高，NO水平降低（P<0.05）。见表2。

表2 各组大鼠血清MCP-1、NO水平比较Table 2 Comparison of serum MCP-1 and NO levels of rats in each group(±s,n=10)

表2 各组大鼠血清MCP-1、NO水平比较Table 2 Comparison of serum MCP-1 and NO levels of rats in each group(±s,n=10)

与假手术组比较：*P<0.05；与模型组比较：#P<0.05；与银杏叶组比较：@P<0.05。

组别假手术组模型组银杏叶组银杏叶+佛波酯组ρ（MCP-1）/（pg·mL-1）41.57±5.58 116.55±12.56*47.57±5.39#70.07±8.85@c（NO）/（μmol·L-1）23.45±2.42 5.17±0.49*19.60±1.34#10.30±1.24@

2.4 大鼠颈动脉血管PCNA阳性率

免疫组化染色显示，假手术组PCNA表达较少，模型组PCNA表达显著增加，相较于模型组，银杏叶组及银杏叶+佛波酯组PCNA 表达有所减少。假手术组、模型组、银杏叶组、银杏叶+佛波酯组颈动脉血管PCNA 阳性率分别为（6.81±0.84）%、（58.36±7.49）%、（20.99±2.43）%、（31.78±4.18）%。与假手术组比较，模型组PCNA 阳性率升高（P<0.05）；与模型组比较，银杏叶组PCNA 阳性率降低（P<0.05）；与银杏叶组比较，银杏叶+佛波酯组大鼠血清PCNA阳性率升高（P<0.05）。见图1。

图1 颈动脉血管PCNA阳性细胞（免疫组化染色，400×）Figure 1 PCNA-positive cells in carotid artery（immunohistochemical staining，400×）

2.5 大鼠颈总动脉内膜增生率及管腔狭窄指数

假手术组颈总动脉血管管壁结构清晰、完整，未观察到增生及管腔狭窄；模型组内弹力板破裂，从正常波浪状转变为平坦无弹性，内膜表面有少量红细胞，中膜层平滑肌细胞排列紊乱，外膜层结缔组织排列松散，管腔面积缩小；银杏叶组、银杏叶+佛波酯组上述变化较模型组有所改善，其中银杏叶组改善程度更为明显。见图2。与假手术组比较，模型组颈总动脉内膜增生率升高，管腔狭窄指数降低（P<0.05）；与模型组比较，银杏叶组颈总动脉内膜增生率降低，管腔狭窄指数升高（P<0.05）；与银杏叶组比较，银杏叶+佛波酯组颈总动脉内膜增生率升高，管腔狭窄指数降低（P<0.05）。见表3。

图2 颈总动脉内膜及管腔（HE染色，40×）Figure 2 Common carotid artery intima and lumen（HE staining,40×）

表3 各组大鼠颈总动脉内膜增生率及管腔狭窄指数比较Table 3 Comparison of intimal hyperplasia rate and lumen stenosis index of common carotid artery in rats of each group(±s,n=10)

表3 各组大鼠颈总动脉内膜增生率及管腔狭窄指数比较Table 3 Comparison of intimal hyperplasia rate and lumen stenosis index of common carotid artery in rats of each group(±s,n=10)

与假手术组比较：*P<0.05；与模型组比较：#P<0.05；与银杏叶组比较：@P<0.05。

组别假手术组模型组银杏叶组银杏叶+佛波酯组内膜增生率/%6.48±0.75 139.20±16.53*15.05±1.37#42.41±5.80@管腔狭窄指数0.90±0.06 0.43±0.05*0.75±0.09#0.64±0.07@

2.6 大鼠颈总动脉组织p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-ERK1/2/ERK1/2的表达

与假手术组比较，模型组颈总动脉组织p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-ERK1/2/ERK1/2 升高（P<0.05）；与模型组比较，银杏叶组颈总动脉组织p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-ERK1/2/ERK1/2 降低（P<0.05）；与银杏叶组比较，银杏叶+佛波酯组颈总动脉组织p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-ERK1/2/ERK1/2升高（P<0.05）。见表4，图3。

图3 颈总动脉组织NF-κB p65、p-NF-κB p65、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达量Figure 3 Expression of NF-κB p65, p-NF-κB p65,ERK1/2 and p-ERK1/2 in common carotid artery tissue

表4 各组大鼠颈总动脉组织p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-ERK1/2/ERK1/2比较Table 4 Comparison of p-NF-κB p65/NF-κB p65 and p-ERK1/2/ERK1/2 in common carotid artery tissue of rats in each group(±s,n=10)

表4 各组大鼠颈总动脉组织p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-ERK1/2/ERK1/2比较Table 4 Comparison of p-NF-κB p65/NF-κB p65 and p-ERK1/2/ERK1/2 in common carotid artery tissue of rats in each group(±s,n=10)

与假手术组比较：*P<0.05；与模型组比较：#P<0.05；与银杏叶组比较：@P<0.05。

组别假手术组模型组银杏叶组银杏叶+佛波酯组p-NF-κB p65/NF-κB p65 0.10±0.01 0.88±0.09*0.22±0.02#0.30±0.04@p-ERK1/2/ERK1/2 0.11±0.01 0.81±0.10*0.30±0.03#0.44±0.05@

3 讨论

颈动脉狭窄是由颈动脉粥样斑块造成颈动脉管腔狭窄，从而引发的脑缺血疾病，常发于颈内动脉起始段及颈总动脉分叉，发病始于血管内膜平滑肌细胞、巨噬细胞异常聚集，胶原、脂质及弹力纤维等基质增加，平滑肌细胞随之增生，动脉逐渐钙化，弹性减低、管腔变窄，从而阻碍血液流动[8]。CAS 治疗可通过机械挤压扩大动脉粥样硬化狭窄段，撕裂粥样硬化斑块，重塑为新的平滑内腔，其过程可损伤动脉内壁，术后再狭窄则是血管对内壁损伤过度修复的结果。高龄、合并高血压、合并高血脂、合并糖尿病及术前狭窄程度高是CAS 术后再狭窄的主要危险因素，血管内膜异常增生被认为是其发生的主要病理机制[9]。动脉内壁损伤后平滑肌细胞亦大量增殖、分裂，细胞外基质随之合成积聚，增殖抑制因子合成减少，内皮细胞受损后释放大量炎症因子，继发反应进一步促进平滑肌细胞异常增生并迁移至受损部位，动脉血管内膜代偿性增粗重塑，管腔比例及形状改变，导致再狭窄发生[10]。因此，抑制血管内膜异常增生是治疗CAS术后再狭窄的关键。

MCP-1 是由单核细胞及巨噬细胞分泌一种趋化因子，具有双向调节作用，可在机体损伤后与血管受体结合，发挥其抵御轻度损伤的作用，但其亦可加剧动脉粥样硬化发展，促进平滑肌细胞增殖及内膜组织增生，其水平升高代表动脉粥样硬化加剧及CAS 术后再狭窄风险增加[11]。NO 是内皮细胞分泌的一种抑制增生因子，可升高细胞内环磷酸鸟苷水平，从而抑制细胞增殖[12]。PCNA 是细胞增殖所需的重要核蛋白，其表达水平与DNA复制效率呈正相关，可用于判断细胞增殖活性高低[13]。中医认为CAS 术后再狭窄是一种医源性疾病，患者正气亏虚、腑脏衰退，以致瘀血阻滞、血脉不通，CAS 术乃破血逐瘀之法，虽消瘀通痹、疏通脉络，但过度扩张亦损脉络，气血未得正常灌注，瘀血内阻，血瘀之证复始，故应以益气活血、化瘀通络为主[14]。银杏叶取自银杏科植物银杏干燥叶，可活血、止痛、化瘀，含有银杏黄酮甙及银杏苦内酯，二者可协同消除血管壁沉积，增加血流量，抑制红细胞聚集凝固，从而保护心脑血管[15]。姚海艇等[16]研究认为，银杏叶提取物联合辛伐他汀可有效改善血脂代谢异常，缩小粥样硬化斑块，从而对颈动脉狭窄产生治疗作用，提示银杏叶提取物或可作为动脉粥样硬化辅助治疗推广药物。本研究结果显示，与模型组比较，银杏叶组血清TNF-α、IL-6、MCP-1 水平，PCNA 阳性率，内膜增生率降低，血清NO 水平、管腔狭窄指数升高，提示银杏叶提取物可抑制炎症反应，缓解动脉粥样硬化，抑制内膜增生，治疗血管再狭窄。

NF-κB 是机体内一种多功能性转录因子，可与不同的基因启动子特异性结合，调控相关基因表达，在细胞增殖、分化、迁移及炎症反应、免疫应答等多种生物学过程中发挥重要作用，其中NF-κB p65、ERK1/2 是NF-κB 通路重要调控蛋白。静息状态下，NF-κB p65与另一亚基p50及其抑制蛋白结合为聚合体，在细胞质中保持非活性状态，当其被上游细胞因子刺激后，NF-κB p65 活化解离并转移至细胞核，级联反应信号刺激下游ERK1/2 磷酸化，启动多个促增殖因子转录，加剧内膜增生[17]。王芳等[18]研究认为，抑制NF-κB/ERK 通路可降低内膜组织增殖及侵袭能力，从而抑制子宫内膜异位症大鼠病灶生长及腺体增生。本研究结果显示，与假手术组比较，模型组颈总动脉组织p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-ERK1/2/ERK1/2 升高，经银杏叶提取物干预后均降低，且在银杏叶提取物基础上增用NF-κB 通路激活剂佛波酯可减弱银杏叶提取物对大鼠球囊损伤后颈动脉再狭窄的治疗作用，提示银杏叶提取物可能通过介导该通路治疗大鼠球囊损伤后颈动脉再狭窄。

综上所述，银杏叶提取物可抑制炎症反应，缓解动脉粥样硬化，抑制内膜增生，治疗球囊损伤后颈动脉再狭窄，其作用机制可能与抑制NF-κB/ERK信号通路活性有关，为临床该药物的使用提供了实验基础。由于中药提取物具有多靶点、多机制的特点，下一步需持续研究银杏叶提取物治疗球囊损伤后颈动脉再狭窄的可能机制，为临床靶向药物的开发提供更多参考靶点。