3种客观赋权法比较优选健胃除痞颗粒的提取工艺

李洁环，张建军，冯健英，陈雪婷，徐文杰，李智勇

［广东省第二中医院（广东省中医药工程技术研究院）/广东省中医药研究开发重点实验室，广东 广州 510095］

健胃除痞方由乌药、柴胡、白芍、佛手、豆蔻、佩兰等药味组成，具有疏肝行气、健胃除胀、消痞除满之功效，临床上用于治疗慢性胃炎、萎缩性胃炎等引起的痞满嘈杂、胃胀、嗳气、胃痛灼热等症。原方汤剂内服，临床疗效显著，但存在煎煮、携带、使用不方便等缺点，拟将其开发制成颗粒剂，现对其水提取工艺进行研究。由于中药化学成分复杂，选择单一成分的含量进行质量监测不足以全面反映制剂的质量；因此，本研究选择乌药中去甲异波尔定质量浓度、白芍中芍药苷质量浓度以及固形物质量作为评价指标，多指标综合评价优化提取工艺条件。在进行综合评价时，各指标权重系数的确定尤为关键，其合理性直接影响评价结果的可靠性和正确性[1]。客观赋权法是依据原始数据间的相关关系，通过一定的数学方法，经统计分析、计算，来获得权重的一种赋权方法，其结果不依赖于人的主观判断，不受人为主观偏好的干扰，客观性强，使评价结果更具可信性[2]。本文拟采用熵权法、标准离差法、基于指标相关性的权重确定方法（criteria impor‐tance through intercriteria correlation,CRITIC）建立权重，分析比较3种客观赋权法得到的结果，优化确定最佳提取工艺条件。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent1200 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；HH-8数显恒温水浴锅[邦西仪器科技（上海）有限公司]；KQ-300DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；JJ500 型电子天平（0～500 g/0.01 g，常熟市双杰测试仪器厂）；XS205DU 电子分析天平（0～220 g/0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多有限公司）；PTHW 型调温电热套（巩义市予华仪器有限责任公司）；Heidolph 旋转蒸发仪（德国Heidolph 公司）；DHG-9203A鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）。

1.2 试药

乌药等饮片购自广州市中芝源中药有限公司，经广东省中医药工程技术研究院刘法锦研究员鉴定，乌药（产地：浙江）为樟科植物乌药Lindera aggregata（Sims）Kos-term.干燥块根的加工炮制品，白芍（产地：安徽）为毛莨科植物芍药Paeonia lactifloraPall.干燥根的加工炮制品，其余饮片经鉴定均为正品。试验所用饮片经检验，质量均符合《中国药典》2020年版一部各饮片项下的有关规定。

去甲异波尔定（批号111825-201201）、芍药苷（批号110736-201539）对照品购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯（德国默克），水为蒸馏水，甲酸、磷酸等其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 评价指标的建立

2.1.1 去甲异波尔定、芍药苷的测定

2.1.1.1 色谱条件 去甲异波尔定：Kromasil 100-5-C18色谱柱，以乙腈∶（0.5%甲酸-0.1%三乙胺）（体积比9∶91）为流动相，柱温25 ℃，检测波长280 nm，流速1 mL/min。芍药苷：Agilent Eclipse Plus C18色谱柱，以乙腈-0.1%磷酸（体积比13∶87）为流动相，柱温25 ℃，检测波长230 nm，流速1 mL/min。

2.1.1.2 对照品溶液的制备 分别取去甲异波尔定、芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，摇匀，制成质量浓度分别为298.4、280.9 μg/mL 的储备液。取上述去甲异波尔定、芍药苷对照品储备液各0.25、0.6 mL，分别置1 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为74.6、168.5 μg/mL 的去甲异波尔定、芍药苷对照品溶液。

2.1.1.3 供试品溶液的制备 按处方比例，称取乌药等饮片260 g，加水提取2 次，每次加8 倍量水，提取1 h，合并提取液，200 目筛滤过，滤液浓缩并定容至250 mL。精密移取浓缩液1 mL，置5 mL量瓶中，加甲醇适量，超声处理（功率300 W，频率40 kHz）25 min，放冷，加甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，即得去甲异波尔定供试品溶液。另精密量取浓缩液1 mL，置10 mL量瓶中，加稀乙醇适量，同法操作制备芍药苷供试品溶液。

2.1.1.4 阴性对照溶液的制备 按处方比例，称取除乌药外的其余饮片，按上述供试品溶液的制备方法制备缺乌药的阴性对照溶液。同法制备缺白芍的阴性对照溶液。

2.1.1.5 专属性考察 精密吸取上述去甲异波尔定对照品、供试品和缺乌药的阴性对照溶液各8 μL 进样测定，结果表明，去甲异波尔定对照品和供试品溶液在相同位置处有一色谱峰，阴性对照溶液未见该色谱峰。另精密吸取上述芍药苷对照品、供试品和缺白芍的阴性对照溶液各5 μL 进样测定，结果表明，芍药苷对照品和供试品溶液在相同位置处有一色谱峰，阴性对照溶液未见该色谱峰。上述色谱条件下，去甲异波尔定、芍药苷基本上可达到基线分离，峰对称性良好，分离度均大于1.5，理论塔板数以去甲异波尔定峰计算不低于5 000，以芍药苷峰计算不低于2 000，表明去甲异波尔定、芍药苷的测定方法专属性良好，色谱图见图1和图2。

图1 去甲异波尔定对照品（A）、供试品（B）、阴性样品（C）的HPLC图Figure 1 HPLC diagrams of the reference substance（A）,test substance（B）and negative sample（C）of norisoboldine

图2 芍药苷对照品（A）、供试品（B）、阴性样品（C）的HPLC图Figure 2 HPLC diagrams of the reference substance（A）,test substance（B）and negative sample（C）of paeoniflorin

2.1.1.6 线性关系考察 精密量取“2.1.1.2”项下去甲异波尔定对照品储备液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，分别置于1 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成质量浓度分别为29.84、59.68、89.52、119.4、149.2、179.0 μg/mL 的对照品溶液，按上述色谱条件进样4 μL，以进样量（X,ng）对峰面积（Y）进行线性回归，得去甲异波尔定的回归方程为Y=2.282X-14.71，r=0.999 9，表明去甲异波尔定进样量在119.4～716.2 ng范围内与峰面积呈良好线性关系。

精密量取“2.1.1.2”项下芍药苷对照品储备液0.15、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8 mL，分别置于1 mL 量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，配制成质量浓度分别为42.13、84.26、112.4、140.4、168.5、224.7 μg/mL的对照品溶液，按上述色谱条件进样5 μL，以进样量（X,ng）对峰面积（Y）进行线性回归，得芍药苷的回归方程为Y=1.493X-29.47，r=0.999 9，表明芍药苷进样量在210.7～1124 ng范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.1.1.7 方法学考察 去甲异波尔定：精密度、重复性、24 h 稳定性试验去甲异波尔定峰面积RSD 分别为1.06%、1.72%、1.93%，平均加样回收率为99.94%，RSD 为1.32%。芍药苷：精密度、重复性、24 h 稳定性试验芍药苷峰面积RSD 分别为1.34%、1.57%、1.89%，平均加样回收率为99.33%，RSD为1.14%。

2.1.2 固形物质量的测定 精密吸取各样品浓缩液50 mL，置已恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，照干燥失重测定法（《中国药典》2020年版四部0831项）测定，按公式：固形物质量=W÷50×250 计算固形物质量，其中W为50 mL浓缩液的固形物质量。

2.2 正交试验设计及结果

2.2.1 正交试验设计

采用L9（34）正交试验法，以乌药中去甲异波尔定质量浓度、白芍中芍药苷质量浓度和固形物质量为评价指标，对影响提取工艺的提取次数、提取时间、加水量进行考察。

2.2.2 样品的制备

按处方比例，称取乌药、柴胡、白芍等饮片9份，每份260 g，按表1正交试验设计表的安排进行提取，提取液200目筛滤过，滤液浓缩并定容至250 mL。

2.2.3 样品评价指标的测定

按“2.1.1.1”项色谱条件进样测定（去甲异波尔定样品进样8 μL，芍药苷样品进样5 μL），计算9 份正交样品中去甲异波尔定和芍药苷质量浓度，并测定固形物质量，结果见表1。

2.2.4 数据的无量纲化处理[3-4]为消除各指标量纲不同对方案决策的影响，先对表1数据进行无量纲化处理，使数据处于［0，1］之间，公式如下：

表1 正交试验设计及结果Table 1 Orthogonal experimental design and results

式中：Yij为第i个评价对象的第j个评价指标的无量纲化处理数值；Xij为第i个评价对象的第j个评价指标的原始数值；maxXij和minXij分别表示第i个评价对象在第j个评价指标上的最大值和最小值。数据处理结果见表2。

表2 数据无量纲化处理结果Table 2 Data dimensionless processing results

2.2.5 指标成分权重的确定

2.2.5.1 熵权法确定权重[5-7]熵原本是一个热力学概念，后被引入信息论中，用来度量信息量的多少。熵权法中，可以用熵值（Ej）来判断某个指标的离散程度，其信息熵Ej越小，指标的离散程度越大，变异程度越大，该指标对综合评价的影响（即权重Wj）就越大。信息熵Ej、各指标客观权重Wj的计算公式如下：

式中：Ej为第j个评价指标的熵值；Pij为第i个评价对象在j指标下的概率；m为被评价对象的数目；n为评价指标的数目；Wj为第j个评价指标的权重。计算结果见表3、4。

表3 各指标的Pij值Table 3 Pij value of each index

2.2.5.2 标准离差法确定权重[1,8-9]标准离差法主要是根据指标变异性的大小来确定权重。指标的标准差越大，其变异程度就越大，在综合评价中所起的作用也越大，则其权重也应越大。反之，指标的标准差越小，表明其指标值的变异程度越小，提供的信息量越小，权重也应越小。标准差（Sj）、各指标权重（Wj）的计算公式如下：

表4 各指标的Ej值和Wj值Table 4 Ej and Wj value of each index

式中：Sj为第j个指标无量纲化测度值的样本标准差；Yij为第i个评价对象的第j个评价指标的无量纲化数值；为第j个指标无量纲化数值的样本平均值；Wj为第j个评价指标的权重；m为被评价对象的数目；n为评价指标的数目。计算结果见表5。

表5 各指标的Sj 值和Wj值Table 5 Sj and Wj value of each index

2.2.5.3 CRITIC 法确定权重[10-12]CRITIC 法是一种以评价指标间的对比强度及冲突性作为基础，综合衡量客观权重的计算方法。对比强度以标准差（Sj）来体现，Sj越大，各方案之间的取值差距越大。冲突性以指标间相关性为基础，以Rj的形式来体现，如果两指标之间具有较强的正相关，说明两个指标冲突性较低，表明这两个指标反应的信息较为相似。设Cj表示第j个指标所包含的信息量，Cj越大，则第j个指标所包含的信息量越大，该指标的相对重要性也就越大，客观权重（Wj）就越大。利用SPSS 软件计算出各评价指标间的相关系数（rij）矩阵，结果见表6。Rj、Cj、Wj计算公式如下：

表6 各指标间的相关性Table 6 Correlation among indicators

式中：rij为评价指标i和j之间的相关系数，n为评价指标的数目。计算结果见表7。

表7 各指标的Rj、Cj、Wj值Table 7 Rj、Cj、Wj value of each index

2.2.5.4 综合评价结果的比较分析 分别采用经熵权法、标准离差法、CRITIC 法分析得到的权重系数对正交试验结果进行综合加权评分，以去甲异波尔定质量浓度、芍药苷质量浓度、固形物质量9次试验的最大值为100 分，将各指标成分的总量分别转换为评分值，再乘以相应的权重系数后求和，得综合评分值，公式如下：

式中：A为去甲异波尔定质量浓度，B为芍药苷质量浓度，C为固形物质量，max 为正交9 次试验的最大值，W为权重系数。分析结果见表8。

表8 3种赋权法综合评分结果分析Table 8 Analysis of comprehensive scoring results of three weighting methods

结果表明，3 种赋权法得到的综合评分值相差不大，较为接近，但各正交试验综合评分的排序存在微小的差异，分值最高的均是正交5，正交3、6、7、9 的排名有所不同。采用Kendall 协调系数W检验对3 种评分结果进行一致性检验[13-15]，结果显示：Kendall 协调系数W=0.985，χ2=23.644，P=0.003<0.01，表明3 种赋权法对各正交试验的排名具有较高的一致性，其差异不具有统计学意义。由于CRITIC法不仅考虑了指标变异大小对权重的影响，还考虑到各指标之间的冲突性，更为全面，可减少指标之间信息熵的重叠，更有利于得到可信的评价结果，综合考虑，确定采用CRITIC 法确定的权重系数进行综合评分。

2.2.6 正交试验结果分析

采用CRITIC 法确定的权重系数对正交结果进行综合评分，并进行方差分析，结果见表9、10。

表9 直观分析表Table 9 Visual analysis

表10 方差分析表Table 10 Variance analysis

结果表明，因素A（提取次数）、因素C（加水量）对试验结果的影响有统计学意义，因素B（提取时间）对试验结果影响无统计学意义。因此，提取工艺条件确定为：A3B1C3，即加水提取3 次，每次加10倍量水，提取1 h。

2.3 验证试验

按处方比例，称取乌药、柴胡、白芍等饮片3份，每份260 g，按优选的工艺条件提取，200 目筛滤过，滤液浓缩并定容至250 mL。照上述方法测定去甲异波尔定质量浓度、芍药苷质量浓度、固形物质量，结果见表11。

表11 提取工艺验证结果Table 11 Validation results of extraction process

结果表明：验证试验平均综合评分值为98.12，与正交试验综合评分值最大值（98.38）接近，表明优选的工艺参数稳定、合理。

3 讨论

实验前期对处方中其他药味的含量测定方法进行了考察，结果发现柴胡中柴胡皂苷a、d 的稳定性较差，这可能是由于其结构中含有环氧醚键，在高温条件下易开环发生转化；而乌药中乌药醚内脂由于属于脂溶性成分，传统水煎法或水提法不易将它溶出，使它在水提浓缩液中的煎出率低、含量很小[16]；此外，佛手中橙皮苷成分含量测定方法有干扰，因此，均暂不列为评价指标。

现阶段的中药提取工艺综合评价方法常用的仍然是经验性权数法，受决策者主观上的重视程度影响较大。客观赋权法是一种建立在原始样本数据上，经数学方法统计分析、处理后获得权重的方法，它不受人为主观偏好的干扰，具有较强的数学理论依据，客观性强[2，17]。本文采用熵权法、标准离差法、CRITIC 法3 种客观赋权法，对正交试验数据分别进行分析、处理、计算，用所计算得到的权重进行综合评分，对评分结果进行一致性检验，结果表明3 种赋权法的排名具有较高的一致性。在3 种客观赋权法中，熵权法和标准离差法都是根据指标变异性的大小来确定权重，CRITIC法则不仅考虑了变异对于指标的影响，同时还考虑到各指标之间的相关性、冲突性，因此，CRITIC 法要比熵权法、标准离差法更加全面，且对于多指标多对象的综合评价问题，采用CRITIC 法可消除一些相关性较强的指标的影响，减少指标之间信息熵的重叠，更有利于得到可信的评价结果[18-19]。因此，最终确定用CRITIC法计算的权重系数进行分析，优选得到的最佳工艺条件为：提取3次，每次加10倍量水，提取1 h。该条件下，去甲异波尔定质量浓度为197.0 µg/mL、芍药苷质量浓度为1.34 mg/mL，固形物质量为56.81 g，综合评分值为98.12，与正交试验综合评分值最大值（98.38）接近，表明工艺合理可行。