糖尿病中肾纤维化与miRNA相关研究进展

王亚楠，李勇，高仕奇，韦妙灵，胡祖梁，付灿

（桂林医学院生物技术学院，广西 桂林 451000）

0 引言

国际糖尿病联合会和世界卫生组织的估计，糖尿病影响着全球超过4亿人[1]。糖尿病大多数是由疾病并发症引起，包括慢性肾功能不全、心力衰竭、肝功能不全、视网膜病变和周围神经病变等。纤维化是细胞外基质(ECM)过度沉积，经常在糖尿病组织中发现，高血糖和胰岛素能激活成纤维细胞并且刺激免疫细胞、血管细胞等特异性实质细胞发生纤维化。成纤维细胞来源于多种细胞系，包括成纤维细胞、平滑肌细胞、通过上皮或内皮间充质转化(EMT)的上皮细胞和内皮细胞以及纤维细胞。当肌成纤维细胞合成过量的胶原蛋白和其他ECM蛋白时，由此产生的纤维化可导致心肌梗死、心肌病和心力衰竭,因此由糖尿病引起的肾纤维化通常认为是不可逆的。高血糖引起的肾纤维化涉及多种机制：激活神经体液通路，诱导、激活生长因子(如TGF-β)，刺激促炎细胞因子(如TNF-α、IL-1β)，诱导整合素及分泌基质细胞蛋白(如TSP-1、SPARC、CCN2)。此外，高糖会破坏ROS诱导的DNA修复，导致持续损伤，促进细胞衰老、炎症激活和纤维化[2]。

1 MicroRNA介绍

MicroRNA是高度保守的短链非编码RNA，是一种调控多种基因蛋白表达的非编码单链小RNA。通过与3’-UTR结合，抑制mRNA表达以促进或抑制糖尿病肾病发病机制[3]。自从第一个miRNA在1993年被克隆以来，已经鉴定出超过2000个人类成熟miRNA，目前至少有60%的人类蛋白质编码基因受miRNAs调控。大量证据表明，miRNAs的异常表达可能是各种疾病的发展的基础，包括糖尿病引起的各种器官纤维化[4-5]。miRNA失调可破坏足细胞稳态，增进上皮间质转化（EMT）途径，使得纤维化和肾小球功能障碍相关的ECM蛋白的积累[6-7]。因此，miRNA作为疾病生物标志物的作用不可忽视，现将围绕不同miRNA对DKD的影响进行综述。

2 MicroRNA与糖尿病性肾纤维化

2.1 miRNA-21

作为第一批人类miRNA基因之一，miR-21已被广泛用于各种疾病的研究，包括肾纤维化[8-9]。miR-21参与肾脏疾病的急性和慢性阶段，并且在疾病的早期和晚期有不同的作用[10]。大量证据证明由TGF-β诱导的多细胞系中miR-21的表达上调[11]。在缺血再灌注损伤(IRI)诱导的急性肾损伤（AKI）中，通过激活炎症反应，促使上皮细胞的调亡和纤维化[12]。炎症过程中，巨噬细胞通过两种途径激活肾成纤维细胞中miR-21的表达：1、巨噬细胞分泌过量的白细胞介素-6(IL-6)，激活STAT3，进一步诱导肾成纤维细胞中miR-21的过表达。2、巨噬细胞分泌富含miR-21的小胞外囊泡，转移到肾成纤维细胞[13]。miR-21过表达可抑制Notch2进而诱导纤维化标志物α-SMA和胶原I增加，所以miR-21可作为肾纤维的标志靶点。在接受腹膜透析的患者中发现miR-21在接受纤维化的腹膜中上调，并且在透析流出物中是稳定的，这表明miR-21是一种有前途的生物标志物，可用于监测接受腹膜透析治疗的患者的腹膜[14]。

miR-21可调控TGF-β1的下游分子，并作为肾脏中的促纤维化分子参与TGF-β1介导的纤维化信号通路。麦克莱兰等人发现miR-21促进肾纤维化是通过靶向Smad7、磷酸酶和紧张素同源物(PTEN)，通过Smad3和PI3k-TGF-β1信号通路，使得Smad3增加及AKT磷酸化，最终ECM堆积而导致纤维化[15]。miR-21不仅调控10号染色体上缺失的磷酸酶和紧张素同源物(PTEN)，而且还靶向Fas配体(FasL)，通过AKT通路正向调控而抑制细胞凋亡[16]。

此外，在其他缺血/再灌注诱导AKI病例中，miR-21具有肾保护作用。miR-21通过阻止肾上皮细胞凋亡以及抑制炎症反应来保护肾脏免受缺血/再灌注诱导的AKI[12]。与AKI不同，在糖尿病肾病小鼠模型中，miR-21主要在皮质肾小球和肾小管细胞中表达，诱导肾纤维化，最终导致DKD[17]。在糖尿病肾病小鼠模型中，抑制miR-21表达可显著降低炎症反应及细胞凋亡，并降低I型胶原、α-SMA和FN（纤维连接蛋白）的表达量[17]。此外，TGF-β1不仅在心脏成纤维细胞中激活miR-21过表达，还通过Smad3激活肾小管上皮细胞(TECs)的表达[11]，因而抑制Smad3可以抑制TGF-β1诱导的miR-21的表达，从而防止肾纤维化。

2.2 miRNA-29

miR-29家族(miR-29a/b/c)参加多条信号通 路 的 调 控，如 TGF-β/Smad、Wnt/β-catenin和MAPK，被认为是纤维化肾脏疾病中EMT的关键负调控因子[4]。miR-29能够降低近端小管上皮细胞和足细胞中胶原mRNA水平，通过靶向胶原基质合成过程负调控纤维化。Chen等人发现与糖尿病WT小鼠相比，糖尿病miR-29a转基因小鼠的纤维化因子表达和尿蛋白分泌较低，肾小球纤维化程度也较轻[18]。此外，用AngⅡ对高血压大鼠(SHRs)和人胚胎肾上皮细胞(NRK-52E)处理后，miR-29b表达降低，而TGF-β、α-SMA、胶原I表达上调，导致EMT发生。抗糖尿病药物利那格列汀可以通过靶向DPP-4诱导miR-29上调提供肾保护作用，改善DN小鼠模型的纤维化[19]。因此，miR-29b可能对DN有保护作用。

miR-29b通过靶向特定的纤维化分子（胶原蛋白和α-SMA），其表达被TGF-β1抑制，因此miR-29b家族是TGF-β1介导的纤维生成的重要下游介质[20]。此外，在肾衰竭动物模型中miR-29c表达下调，HIF-α激活使其恢复，TPM1和 COL2A1为miR-29c的靶基因，miR-29c通过抑制TPM1进而预防肾纤维化[21]。miRNA-29a可以通过调控 Wnt /β-catenin 信号通路抑制 TGF-β1 诱导的纤维化[22]。综上所述，miR-29 针对多条信号通路的调节，直接抑制 ECM 相关基因的表达，进而抑制 ECM 的合成与沉积，从而发挥重要的抗纤维化作用。

2.3 miRNA-192

miR-192在肾脏疾病中的表达比其他miRNAs更复杂。研究表明miRNA-192与缺血再灌注肾损伤、肾脏纤维化和高糖肾病密切相关。2007年首次观察到在注射STZ的糖尿病小鼠和db/db小鼠中，miR-192水平显著升高[23]。miR-192在纤维化肾中表达上调，TGF-β1通过Smad 3对miR-192起正调控，并通过Smad 7负调控miR-192的表达。血管内皮生长因子（VEGF）抑制Smad3的表达，进而降低miR-192的表达，从而抑制EMT，从而减轻纤维化[24]。虽然miR-192在TGF-β处理的小鼠间皮细胞和糖尿病小鼠的肾小球中上调，使得MCs中胶原积累增加，但其他学者注意到在糖尿病肾病纤维化的晚期miR-192显著减少，miR-192的低表达与肾小管间质纤维化相关。这些结果表明miR-192，可以作为保护因素，发挥抗纤维化的作用。

进一步研究发现miR-192通过诱导smad互作蛋白SIP1(一种E-box抑制因子)的表达，增加了胶原I-α2(Col1a2)的表达，从而导致糖尿病肾小球胶原沉积和肾纤维化。除SIP1外，miR-192也可以靶向其他两个锌指转录因子Zeb1和Zeb2，从而上调MCs中关键的纤维化基因Col1a2和胶原Ⅳ-α1(Col4a1)[25]。自噬是一种溶酶体蛋白降解途径，在肾脏疾病的发病机制中起着关键作用。有学者发现敲除miR-192基因的小鼠肾小球MCs自噬减少，因此，抑制miR-192可导致自噬激活并且减少糖尿病肾病早期肾小球系膜增生[26]。

2.4 miRNA-30

miR-30家族(miR-30a/b/c/d/e)在肾脏中大量表达，虽然 miR-30家族5个成员之间序列高度相同，但功能却有差别。有研究表明miRNA-30a在肾癌组织和细胞中低表达，miRNA-30a-5p在肾癌细胞中起抑癌基因的作用，miRNA-30a-5p 通过靶向XIAP调节肾癌细胞的增殖凋亡。此外，miR-30a的过表达增强了上皮标记物，但减少了间充质标记物。在db/db小鼠的肾组织和高糖处理的肾TECs中，miR-30e减少，而胶质瘤相关蛋白-2(GLIPR-2)上调，更重要的是，miR-30e过表达抑制GLIPR-2，促进肾TECs增殖，通过下调波形蛋白、α-SMA和上调E-cadherin抑制EMT的形成，最终避免DN的肾纤维化[4]。

miR-30a通过靶向活化T细胞的核因子3(NFATc3)，通过抑制NFATc3的核易位来保护足细胞的细胞骨架紊乱或重排。另一方面，miR-30c已被证明对正常肾稳态至关重要，并在DN中发挥保护作用[4,27]。同时结缔组织生长因子(CTGF)是miR-30c的靶点，miR-30c直接下调CTGF表达进而减轻肾纤维化，改善肾形态结构。相反，在miR-30c基因缺失的小鼠上皮细胞中TGF-β1的分泌增多，并显著促进了EMT。MiR-30e在纤维化肾小管细胞和TGF-β1处理的NRK-52E细胞中表达下调[4]。

miR-30不仅参与糖尿病和肾脏疾病，而且与器官纤维化密切相。miR-30a、miR-30c和miR-30e参与了大鼠和人类对比诱导的急性肾损伤[28]，miR-30的丢失导致心脏纤维化[29]。

2.5 miRNA-34

miRNA34a也可以促进细胞凋亡。肾纤维化患者肾小管上皮细胞和单侧输尿管梗阻(UUO)小鼠梗阻肾中miR-34a表达上调，由此miR-34a促进肾小管间质纤维化。用miR-34a转染近端肾小管细胞可增加α-平滑肌肌动蛋白和纤维连接蛋白的表达，同时降低E-钙粘蛋白的表达。miR-34a通过与Klotho的3UTR直接结合而下调Klotho的表达。相反，Klotho的过表达阻止了miR-34a在HK-2细胞中诱导的EMT。这些结果证明miR-34a升高在肾纤维化的进展中起重要作用[30]。此外，SIRT1为miR-34a-5p在DN中的下游靶基因，在高糖刺激的人近端小管细胞系(HK-2)细胞中，SIRT1 mRNA水平与miR-34a-5p表达呈负相关。miR-34a-5p通过靶向SIRT1的3’非翻译区，直接抑制SIRT1以增加TGFβ1的促纤维化作用[31]。将miR-34c的前体注射到单侧输尿管梗阻小鼠体内，miR-34c减少了肾纤维化面积和结缔组织生长因子、α-SMA、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和纤连蛋白的表达。由此miR-34c可减轻输尿管梗阻小鼠的EMT和肾脏纤维化[32]。这些结果均可表示miR-34a-5p是DN治疗的新靶点。

2.6 miRNA-200

miR-200家 族 (miR-200a/b/c，miR-141和miR-429)是上皮分化的调节因子，主要通过靶向TGF-β/Smad和Wnt/β-连环蛋白信号通路介导EMT形成。在TGF-β1诱导的EMT过程中，miR-200家族的减少在Zeb1和Zeb2对E-cadherin的抑制中起着关键作用。Wang等人发现miR-200a/141通过抑制TGF-β1和TGF-β2表达、激活Smad-3并降低基质蛋白水平，阻止TGF-β介导的EMT和肾纤维生成[33]。在STZ诱导的糖尿病小鼠中，Wei等人揭示了一种新的机制，即高血糖诱导的醛糖还原酶通过转录后靶向miR-200a/141的STZ相关蛋白1(Keap1)，协调控制高糖诱导的肾氧化应激反应、纤维生成和EMT[34]。

miR-200b/c可以通过抑制Zeb1来促进小鼠MCs中胶原和TGF-β1的表达。miR-200b前体通过抑制Ⅰ胶原、Ⅲ胶原和纤维黏连蛋白的合成来改善肾小管间质纤维化。此外，miR-200b/c可以通过靶向GATA结合蛋白2(FOG2)激活Akt，从而抑制磷酸肌醇3-激酶(PI3K)导致DN的肾小球系膜肥大[35]。综上所述，miR-200是DN中肾纤维化的重要调控因子。而miR-200a/141主要作为保护分子，而miR-200b/c主要是促进DN的纤维化和进展。

3 结论

纤维化在糖尿病并发症的发病机制中起着重要的作用，阻碍肾、肝和心功能的发展。miRNA在DKD肾纤维化病程中起到重要作用，其可能依赖于经典的 TGF-β 信号通路或其他非典型信号通路调控EMT和ECM蛋白的表达。然而，miRNA在肾脏疾病发展中的研究仍处于早期阶段， DKD靶向治疗的应用也面临着巨大挑战。我们需要对miRNA在肾纤维化过程中的作用机制不断地探索，为肾纤维化的治疗提供新的线索。