特殊食品中3种B族维生素检测方法的研究进展

于瑞莉，冯永巍，黄丽俊，杨 婷

（无锡市食品安全检验检测中心，国家市场技术创新中心（特殊食品），江苏 无锡 214000）

特殊食品是指为满足某些特殊人群的生理需要，或某些疾病患者的营养需要，按特殊配方而专门加工的食品，包括保健食品、婴幼儿配方食品、特殊医学用途配方食品（简称特医食品）和特殊膳食等。在食品原料中，叶酸、生物素和维生素B12（VB12）是常添加的3种水溶性B族维生素，是人体维持正常生理机能的一类重要且典型的微量营养素，在体内不能自身合成，必须通过食物或外界环境获取和补充[1]。由于特殊食品针对的人群特殊，其添加量要求严格，因此对于这3种水溶性B族维生素的含量测定有非常重要的作用。但由于基质成分复杂，B族维生素添加量较低，且易受光热分解[2]，使检测难度大大增加。本文对叶酸、生物素和维生素B12常用的分光光度计法，荧光法、高效液相色谱、液相-质谱联用法、微生物法和免疫法进行详细分析讨论，旨在为检测工作者寻找一种简便、精准、快速的检测方法提供指导。

1 性质

叶酸（floic acid，维生素B9），包括天然的叶酸和用于强化食品和膳食补充剂的合成叶酸，其化学名称是蝶酰谷氨酸，由蝶呤、对氨基苯甲酸和L-谷氨酸组成，对光敏感。叶酸缺乏会使单碳代谢严重异常，可导致慢性疾病和发育障碍，包括神经管缺陷[3]、巨红细胞型贫血、癌症及神经障碍等多种疾病。但是过量摄入合成叶酸又会引起并发症[4-5]，如干扰人体对锌的吸收，增加下一代患自闭症的风险等。一般正常人叶酸的需求量为200～400 µg/d，世界卫生组织建议成人至少为200 µg/d，孕妇和母乳为400 µg/d，不同年龄、不同阶段的人需求量不同[6]。

生物素（biotin，维生素B7），是合成维生素C的必要物质。含3个不对称碳原子的双环化合物[7]共有8种同分异构体，稳定性较好。作为羧化酶、羧基转移酶、脱羧酶的辅酶参与人体的糖异生、脂肪酸和氨基酸代谢、能量传递过程。其长期摄入不足会影响蛋白质及RNA合成，降低身体免疫力[8]。

维生素B12（cobalamin，钴胺素），是一类含有钴离子的咕啉类化合物总称[9]，是唯一含有金属离子的水溶性维生素，在空气中不稳定，对光敏感。以辅酶形式参与各种代谢过程，在造血和健全神经系统功能方面有重要作用。缺乏维生素B12不仅导致巨幼红细胞贫血，还会引起心脏病，神经紊乱，老年痴呆和帕金森综合征等神经系统疾病[10-11]。

国家食品安全监督抽检对特殊食品中3种B族维生素的含量要求非常严格（见表1）[12]。由表可见，特殊膳食食品中尤其是孕、乳母营养补充食品、婴儿配方食品对维生素添加量有严格的要求，特殊医学用途婴儿配方奶粉和婴幼儿配方奶粉对3种B族维生素含量区间要求更窄，含量更低，需要检测方法具备更高的灵敏度和更低的检出限。

2 检测方法

2.1 比色法

维生素检测开展初期，比色法有较广的普适性。叶酸检测分为直接比色和衍生物比色法两种。直接比色法是在碱性溶液中将叶酸溶解，测定叶酸的特征峰吸收值，从而确定样品中叶酸含量。衍生法则需对样品进行前处理，使用衍生化试剂与叶酸反应，合成其他稳定且具有特征吸收峰的物质后再进行紫外测定。常用的衍生试剂有茚三酮、高锰酸钾、N-(1-N)-二乙二胺等[19]。生物素测定则用无水乙醇提取，在硫酸乙醇溶液中生成橙红色化合物，在一定范围内颜色深浅与生物素含量成正比，根据吸光度即可判断生物素的含量[20]。维生素B12在 278，361和550 nm波长处有最大吸收，可使用紫外-可见光分光光度计法进行含量测定[21]。该方法虽然操作简单，但易被样品中其他物质干扰，受仪器分辨率和样品本底的影响较大，影响测定结果的准确度和精确性，因此不太适宜特殊食品中叶酸、生物素和维生素B12的检测。

2.2 荧光法

对于自身含有荧光特性或是与标记物结合发光的 B 族维生素，可使用荧光法测定。生物素和维生素B12不具有荧光特性，关于此方法的研究鲜有报道。只有叶酸结构中的吡嗪嘧啶环含有特殊的吸收光谱,紫外光可将其转化为荧光产物，采用荧光法和其他检测手段相结合的方式进行测定。陈琼等[22]采用固相萃取-HPLC柱后氧化衍生荧光法测定运动营养食品中叶酸的含量，赵海燕等[23]采用HPLC-柱后光化学衍生-荧光检测方法，用于强化食品中叶酸测定。具有灵敏度高，重现性强的优点，但它的缺点在于前处理复杂，不具备高效快速的特点，且检出限较低，适用于特殊膳食但不适用于特医食品和婴幼儿配方食品中叶酸的检测。

2.3 高效液相色谱法

高效液相色谱法（HPLC）已普遍用于特殊膳食中维生素测定。耿瑛等[24]采用钛胶反相色谱柱，建立了同时测定功能饮料中的生物素、叶酸、维生素B12等5种维生素的HPLC法。孙璐璐等[25]通过固相萃取-HPLC实现了对营养强化饼干中维生素B12含量的快速精确测定，检出限0.1 mg/kg。

HPLC一般适用于添加形式明确，且含量较高的特殊膳食中维生素的检测。但李贻[26]用HPLC和HPLC-MS分析婴幼儿配方乳粉中B12含量，得出结论：HPLC因检测重复性好，结果准确，适用于维生素B12含量高的样品，但是灵敏度不高，仪器检出限较高，对于含量低的样品不宜准确检出。所以由于方法的局限性，特医食品中叶酸、维生素B12的检测较少采用HPLC。

2.4 液相色谱串联质谱

液相色谱-质谱联用技术（LC-MS/MS）相对于HPLC，有更强大的组分分离与鉴定能力，也有较低的检出限；不仅可准确测定维生素含量较高的特殊膳食，也可测定特医食品和婴幼儿配方食品中维生素含量。张辰辰等[27]利用超高压液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）测定特医食品中生物素、叶酸、维生素B12等8种维生素，定量限为4～10 μg/100 g，加标回收率达85.52 %～116 %，RSD为0.49 %～4.10 %。陈美君等[28]建立了一种能同时测定婴幼儿配方奶粉中 11 种 B 族维生素的超高压液相色谱-串联质谱法，采用电喷雾离子源正离子模式，方法线性范围良好，样品前处理方法简单，灵敏度高。卢兰香等[29]采用免疫亲和柱进行净化，建立了LC-MS测定特医食品中生物素的方法。

但是LC-MS/MS的测定与其标准溶液相关性较强，而这3种维生素在特殊食品中的存在形式较复杂。叶酸衍生物种类多，LC-MS/MS测定的只是不同衍生物的含量，尽管Ndawa等[30]将衍生物转化为5-甲基四氢叶酸或多种纯化方式分别测得多种衍生物含量，但是叶酸及其衍生物不稳定，且易在提取和测定过程中发生氧化降解或衍生物间相互转化，导致难以准确测定叶酸总量。而维生素B12的主要存在形式包括羟基钴胺素、氰基钴胺素、脱氧腺苷钴胺素和甲基钴胺素[31]，不同于允许添加到食品中的维生素B12的种类（氰钴胺、羟钴胺和盐酸氰钴胺）[32]，且维生素B12几乎都是借助于微生物发酵获得，其基质复杂，仪器法难以满足准确测定要求。生物素有8种同分异构体，陈杰峰等[33]通过同位素内标和LC-MS/MS测定的婴幼儿配方奶粉中B6和生物素含量，其中生物素质控样品测定值（每100 g 含0.1906 mg）低于质控样品特性值区间（每100 g 含1.346±0.093 mg），且6个实际样品的检测结果普遍低于国标法，最高偏差达3.9 %，可见LC-MS/MS并不能准确测定婴幼儿配方食品中生物素的含量。LC-MS/MS作为更先进的手段，尽管具有较低的检出限，更高灵敏度，更简单的操作，但是在特医食品和婴幼儿配方食品叶酸、生物素和维生素B12检测的准确性和全面性方面还存在缺陷。

2.5 微生物法

目前，传统微生物法是我国现行检测标准，同时也是美国官方分析化学家协会（AOAC）和美国药典（USP）的推荐方法。我国现行检测方法为：《GB5009.211-2014 食品安全标准 食品中叶酸的测定》[34]、《GB5009.259-2016食品安全标准 食品中生物素的测定》[35]和《GB5413.14-2010食品安全标准 婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定》[36]。

叶酸主要是以叶酸衍生物的形式存在[37]，最主要的天然叶酸形式包括[38]：5-甲酰四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、四氢叶酸和叶酸；不同叶酸衍生物又包含单谷氨酸形式和多聚谷氨酸形式的叶酸，具有生物活性的多达100余种[39-40]。生物素共有8种同分异构体，但只有全顺式结构的D-生物素具有生理活性[41]，D-生物素的存在形式又分为游离状态与结合状态。维生素B12的存在形式也不单一。微生物法利用相应的营养缺陷型菌种对特定维生素有很强的特异性，在一定条件下，其生长和繁殖速度与溶液中维生素的含量成一定对应关系；可测定具有生物活性的维生素，测定结果更准确，范围广，灵敏度高，能满足含量低和基质复杂的特殊食品检测。

但是国标中传统微生物法的诸多缺点也限制了该法的实际应用范围。如叶酸、维生素B12对光敏感，分析过程均需避光操作，对环境要求高；实验关键点多，且要求平行管之间结果偏差不得超过10 %；由于产品实际含量一般高于标示值，精准把握样品稀释倍数，使其落入合适的线性区间的难度加大，导致对检验员的操作水平和检测经验要求提高；为了保证测定用菌种的活力需传代2～3代，莱士曼氏乳酸杆菌活力较差，菌种活化时间需2～4 d，维生素的检测周期一般需要4～6 d；另外如果保存不当或传代过多，菌种易变异失去对维生素的特异性，严重影响检测结果。叶酸测定中所使用的鼠李糖乳杆菌只可测定出单尾形式的叶酸或含2～3个谷氨酸尾的叶酸，对长链的谷氨酸叶酸衍生物的响应较弱[42]。生物素的8种异构体中只有1种具有较高的生物活性，采用微生物法不能分离并测定出该种异构体的含量。另外，陈绪华等[43]研究发现，国产培养所含本底较高，标准曲线线性较差。

此外，微生物法实验过程中需大量的玻璃器皿，所有玻璃器皿及用具均需严格清洗、酸泡和干热灭菌，工作量较大。近年，研究人员也对国标微生物法进行了改进。主要优化方向是缩小反应体系，如微孔板式定量检测试剂盒。涂晓波等[44]对奶粉中生物素、叶酸及维生素B12，利用自主研发与进口维生素检测试剂盒进行了对比分析，发现自主研发试剂盒操作较简便。杨小平等[45]采用EP管代替试管，通过等比例缩小反应测定婴幼儿配方奶粉中叶酸含量，加标回收率为98 %-107.5 %。余文等[46]采用96孔板代替传统培养，酶标仪代替分光光度计，实现了快速检测。但是也存在检测结果偏低的情况，另外试剂盒比较昂贵，检测成本高，普及率较低。诸多问题使微生物法将逐渐被其他简便、快速、准确的方法替代。

2.6 免疫法

免疫学分析技术是基于免疫学原理设计的对目标样本进行定性或定量检测的实验手段。通过免疫分析技术，可实现对抗原、抗体等免疫相关物质的测定。其中，酶联免疫吸附测定法（ELISA）是在免疫酶技术的基础上发展的一种新型的免疫测定技术，是目前最具有发展前景的技术之一，在特殊食品领域已逐步开始应用。李江等[47]采用间接竞争ELISA方法，得出婴幼儿配方奶粉中维生素B12含量，快速灵敏、准确、操作简便、无需贵重仪器设备，检出限3 µg/kg。叶酸测定中，由于单谷氨酸叶酸、多谷氨酸叶酸、叶酸衍生物与叶酸结合蛋白的亲和性不相同，会影响测定的灵敏度，杨霈瑶[19]提出了通过制备叶酸-牛血清白蛋白偶联物的抗体，并在此基础上利用酶免疫试验的基本原理，建立一种简单快速的检测方法。乐振窍等[48]采用ELISA测定功能食品中维生素B12的含量，结果准确度和精密度与AOAC方法达到同等效果。Kong等[49]开发了一种间接竞争性酶联免疫吸附法检测不同营养强化中维生素B12的 4 种主要形式（氰钴胺、羟钴胺、腺苷钴胺和甲钴胺）的方法，其检测限为0.065 ng/ml，回收率为81 %～122 %。

此外，荧光免疫层析技术是免疫法中的基于抗原抗体特异性免疫反应的另一种新型膜检测技术。主要基于抗原抗体特异性识别原理和层析反应模式，能快速、准确地测定特殊食品中维生素含量。刘海英[50]对生物素含量的检测采用荧光微球免疫层析方法，荧光微球等发射光谱型标记物因信号强度可随激发光增强而增强，可有效降低层析方法的检测限。以EDC/NHS介导的两步法偶联合成适用于免疫层析检测的荧光微球探针。荧光微球探针粒度均一、化学及光学性质稳定。以此建立的以生物素为目的物的免疫层析检测方法，最终检测限可达3 ng/ml，远低于其他检测方法；灵敏度亦高于微生物法及HPLC，且检测时间较短，检测成本低廉。

3 讨论

维生素B12、叶酸和生物素的检测方法正处于优化和创新的发展期，找到适合特殊食品中不同样品基质的最佳方法是目前研究人员的努力方向。分光光度法虽然操作简单，但测定结果的准确度低和精确性差，因此不适于检测特殊食品中3种维生素。荧光法可靠性存在缺陷，需要和其他检测手段结合，由于生物素和维生素B12无紫外和荧光发色集团，只适用于特殊膳食中叶酸测定，不适于其他特殊食品的测定；HPLC适用于添加形式明确，且含量较高的特殊膳食中3种维生素检测，但对于某些基质成分较复杂、含量低于仪器检出限的特医食品和婴幼儿配方食品，检测还存在缺陷。LC-MS/MS做为更先进的手段，检出限低，灵敏度高，操作简单，但准确性和全面性方面还有不足。微生物法虽然是目前针对特殊食品这3种维生素的首选方法，特异性好、灵敏度较高，但由于操作关键点多，微生物生长周期长，工作量大，对环境、人员、菌种和培养基要求高等问题，应用有限；相比之下，作为目前研究热点的免疫法而言，有检验灵敏度高、检测限低、特异性好、样本处理量大、检验时间短、准确、操作简便、无需贵重仪器设备等诸多优点，更适用于特殊食品，尤其是特医食品和婴幼儿配方食品的检测，具有广泛的开发空间和应用前景。