基于网络药理学和分子对接探讨“黄芪-黄连”药对治疗儿童肥胖症的作用机制

刘 维，张桂菊，闫文月，吴正雪

（1.山东中医药大学中医学院，山东 济南 250355；2.山东中医药大学第一临床医学院，山东 济南 250011）

肥胖症是热量摄入长期超过消耗，体内未消耗的热量以脂肪的形式储存起来，导致身体脂肪重量超标的代谢性疾病。随着社会发展和生活方式改变，肥胖和超重的人群逐年增多。《中国居民营养与慢性病状况报告（2020年）》显示，我国城乡居民超重肥胖率持续上升，6～17岁、6岁以下儿童青少年超重肥胖率分别高达19 %和10.4 %[1]。有研究表明[2]，全球近10 %儿童有肥胖症的困扰。受家庭结构变化的影响[3]，国内肥胖和超重儿童正逐年增加，如不进行干预，儿童肥胖大概率会持续到成年，进一步诱发高血压、糖尿病、高脂血症、胰岛素抵抗、心功能受损、非酒精性脂肪肝等疾病[4]。研究表明，肥胖症的产生与全身慢性炎症反应[5]、糖耐量异常[6]、肠道菌群[7]、脂肪细胞的增生与肥大[8]等因素相关。

中国传统医学《黄帝内经》对肥胖进行了论述，“人有肥、有膏、有肉”，“肥贵人则膏梁之疾也”。成人肥胖症的中医分型为：（1）胃腑热盛，（2）脾虚痰湿，（3）脾肾两虚[9]。通过前期研究[10-12]，我们发现儿童肥胖与成人病因病机有相似性，又与成人有所不同，不可简单将其视为成人的“缩影”。小儿脾土本不足，加之当下长期高糖高脂饮食的饮食结构，肥甘厚味伤脾，脾主运化功能失常，痰浊膏脂内生，内蕴易化热。儿童肥胖以胃热湿阻、脾虚湿盛证型最为常见，脾肾两虚证所占比例相对较少。

黄芪是豆科植物蒙古黄芪和膜荚黄芪的干燥根部，性温味甘，入肺、脾两经，可益气升阳固表、利水行滞通痹；黄连是毛茛科植物黄连的干燥根茎，性寒味苦，入心、脾、胃、肝、胆、大肠经，可清热燥湿、泻火解毒[13]。黄芪与黄连配伍，二者温寒相宜，补泻兼施，既能益气健脾，又能燥湿化痰，与肥胖症虚实夹杂的病机高度契合。本文应用网络药理学和分子对接相关技术探讨“黄芪-黄连”药对治疗儿童肥胖症，以期为临床广泛使用提供依据。

1 资料与方法

1.1 “黄芪-黄连”活性成分与靶点预测

以“黄芪”“黄连”作为关键词在“中国中药系统药理学数据库与分析平台”（http://tcmspw.com/tcmsp.php，TCMSP）进行搜索，在“Ingredients”界面以口服利用度（oral bioavailability,OB值）≥30 %，类药性（drug-like，DL值）≥0.18[14]，进行ADME（药代动力学和药理学）属性筛选，筛选出黄芪和黄连的主要活性成分；之后在TCMSP网站的“Related Targets”面筛选出黄芪和黄连的预测靶点。筛选结束后，通过Uniprot蛋白质数据库最新版（https://www.uniprot.org）对预测靶点进行对照规范，去除非人源基因后，将蛋白质靶点对照为标准基因名称。

1.2 预测儿童肥胖症相关基因靶点

通过人类基因数据库（Gene Cards，https://www.genecards.org）和人类孟德尔遗传基因数据库（OMIM，https://omim.org），以“childhood obesity”作为关键词进行搜索，删除重复值后，筛选出儿童肥胖症（childhood obedity）的基因靶点。

1.3 药物与疾病共同靶点筛选及蛋白互作网络构建

通过R语言编程，筛选出“黄芪-黄连”药对与儿童肥胖症的共同靶点；将共同靶点导入STRING平台[15]（https://string-db.org），限定种属为人类（Homosapiens），构建出蛋白相互作用网络（PPI）。

1.4 构建药物-化合物-作用靶点-疾病作用网络图

利用Cytoscape3.7.0软件（http://www.cytoscape.org），对筛选出的“黄芪-黄连”药对中的药物、化合物、靶点以及疾病之间的相互关系构建可视化互作网络图。其中药物、化合物、靶点及疾病用“Node”表示，各节点之间的联系用“Edge”表示。

1.5 GO基因生物过程与KEGG通路富集分析

对核心靶点基因进行GO基因生物过程富集（gene ontology）[16]、KEGG信号通路富集（kyoto encyclopedia of genes and genomes）[17]分析，此过程使用Bioconductor生物信息软件包（http://www.bioconductor.org）处理。并对结果进行可视化处理。

1.6 药物有效成分和疾病核心靶点分子对接验证

从TCMSP数据库下载“黄芪-黄连”药对中主要活性物质的3D结构，以“.mol2”格式保存。PDB数据库(https://www.rcsb.org)下载核心靶点蛋白的3D结构，以PDB格式保存。利用PyMol软件去除核心靶点蛋白的水分子及小分子配体，AutoDock软件对其加氢，加电荷，对受体和配体进行分子对接，通过结合能的数值评价其结合活性。

2 结果

2.1 “黄芪-黄连”活性成分与靶点结果

在TCMSP数据库以OB≥30 %，DL≥0.18为筛选条件进行筛选，检索到“黄芪-黄连”活性成分67个（见表1）。通过TCMSP查询，得到“黄芪-黄连”药对的作用靶点共364个。将得到的主要活性成分利用Uniprot数据库进行筛选，找到各自对应的标准化的基因名，删除无效和重复靶点后，得到作用靶点109个。

2.2 儿童肥胖症的疾病靶点

通过OMIM 和Gene Cards分别获取儿童肥胖症靶点112个、 6541个，整理后共得到6600个儿童糖尿病靶点。

2.3 “黄芪-黄连”药对治疗儿童肥胖症共同靶点筛选及互作网络构建

将药对主要成分靶点和儿童肥胖症靶点进行类比分析，共得到药物与疾病共同作用靶点95个（见表2）。

利用PPI网络对共同作用靶点进行分析，得到85个节点和350条边，对其中蛋白质互作频次最高的30个节点进行统计并绘制图形（见图1）。

图1 蛋白频次条形图

由图1可见，“黄芪-黄连”药对的中药成分与丝裂原激活蛋白激酶8（MAPK8）、表皮生长因子受体（EGFR）、白细胞介素-6（IL6）有较高的生物结合活性，可作为其治疗儿童肥胖症的潜在靶点。

2.4 药物-化合物-作用靶点-疾病网络

通过cytoscape3.7.0软件构建药物-化合物-作用靶点-疾病调控网络，共得到135个节点（药对1个，疾病1个，核心活性成分38个，靶点95个）和415条线（见图2）。

图2 药物-化合物-作用靶点-疾病网络图

通过“NetworkAnalyzer”工具进行“度值（degree）”分析，选取度值前5的有效成分作为主要活性成分为：quercetin（槲皮素，drgree：73）、kaempferol（山柰酚，drgree：31）、isorhamnetin（异鼠李素，drgree：15）、7-O-methylisomucronulatol（黄芪异黄烷苷，drgree：15）、formononetin（刺芒柄花素，drgree：11）。

2.5 GO基因生物过程富集分析和KEGG信号通路富集分析

使用GO基因生物过程富集分析，得到106条生物过程， P值从小到大排列，取前20条生物过程可视化（见图3）。

图3 GO功能富集分析图

由图3可见，protein heterodimerization activity（蛋白质异二聚活性）、DNA-binding transcription activator activity,RNA polymerase II-specific（DNA结合转录激活剂活性，RNA聚合酶II特异性）、proximal promoter sequence-specific DNA binding（近端启动子序列特异性DNA结合）、RNA polymerase II proximal promoter sequence-specific DNA binding（RNA聚合酶II近端启动子序列特异性DNA结合）、chromatin binding（染色质结合）、ubiquitin-like protein ligase binding（泛素样蛋白连接酶结合）等生物过程中靶点较为集中。

通过KEGG富集分析，一共得到信号通路119条，取P值最小的25条信号通路可视化（见图4）。

由图4可见，PI3K/Akt signaling pathway（PI3K/Akt信号通路）、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection（卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染）、human cytomegalovirus infection（人巨细胞病毒感染）、MAPK signaling pathway（MAPK信号通路）等是靶基因主要集中的信号通路。

图4 KEGG通路分析

2.6 药对主要活性成分和核心蛋白靶点的分子对接

通过AutoDock1.5.6软件对药对主要活性成分核心蛋白靶点分别进行对接，对接结合能见表3。

表3 药对主要活性成分和核心蛋白靶点对接

其中isorhamnetin（异鼠李素）、formononetin（刺芒柄花素）同丝裂原激活蛋白激酶8（MAPK8）的结合能＜-5 kcal/mol。表明异鼠李素（isorhamnetin）和刺芒柄花素（formononetin）与MAPK8具有较好的结合活性[18]。其对接图见图5。

图5 有效成分分子对接图

3 讨论

本文利用网络药理学和分子对接，构建了药物-活性成分-靶点-疾病网络、有效成分分子对接图，对“黄芪-黄连”药对治疗儿童肥胖的作用机制进行了预测。在筛选出的67个活性成分中，quercetin（槲皮素）、kaempferol（山柰酚）、isorhamnetin（异鼠李素）、7-O-methylisomucronulatol（黄芪异黄烷苷）、formononetin（刺芒柄花素）、hydroxytyrosol（羟基酪醇）、Calycosin（毛蕊异黄酮）等化合物在药物调控网络中发挥重要作用。槲皮素可促进巨噬细胞的吞噬功能，影响细胞因子和炎症介质的分泌，发挥抗炎作用[19]。山柰酚通过抑制IKKβ的活化和IκBα的磷酸化来阻止NF-κB（p65）进入细胞核内，使相关炎症介质的释放受影响，抑制肥大细胞炎症反应；山柰酚还使骨骼肌PI3K/Akt-GLUT信号通路阈值增高，改善儿童肥胖症的主要并发症胰岛素抵抗，起到降低血糖的作用[20-22]。异鼠李素可通过激活PI3K/Akt信号通路影响葡萄糖代谢，进而改善肥胖[23]。刺芒柄花素可通过调节血脂代谢，减少脂肪沉积[24-25]。羟基酪醇可减少氧化应激反应和抑制NF-κB的机制调节脂肪细胞基因表达谱，进而减少巨噬细胞聚集并改善儿童肥胖症炎症[26]。毛蕊异黄酮可通过adiponectin-AMPK-eNO途径影响周围血管周围脂肪组织功能[27]。作为药物的潜在作用成分，如hederagenin（常春藤苷）、berlambine（氧化小檗碱）等，可作为未来药理学作用研究的方向。

本次共筛选出95个共同作用靶点，其中有丝裂原激活蛋白激酶-8（MAPK-8）、表皮生长因子受体（EGFR）、雌激素受体（ESR-1）、血管内皮生长因子（VEGFA）、白细胞介素-6（IL-6）等为关键靶点。研究表明MAPK-8对关键靶点为表皮生长因子受体（EGFR）、有丝裂原激活蛋白激酶-8（MAPK-8）、雌激素受体（ESR-1）细胞的增殖、分化、凋亡等过程有影响，进而抑制脂肪细胞分化[28]。EGFR则可以影响细胞的生长、增殖和分化等生理过程[29]。Khristi等[30]发现缺失ESR-1的小鼠更易肥胖。IL-6作为炎症反应的主要介质，与内分泌也有密切关系。Margareta等[31]发现人肥大细胞功能异常可产生IL-6。有研究表明[32-34]促进新的血管生成有利于健康的脂肪组织扩张，并减少脂肪组织炎症。PDGF/VEGF生长因子家族在血管生成和内皮细胞生长中发挥着重要作用，可通过ERK、PI3K/Akt通路诱导内皮细胞增殖、促进细胞迁移、抑制凋亡等[35-36]。统上，“黄芪-黄连”药对可能通过抑制炎症反应、抵抗细胞凋亡、促进细胞增殖、血管生成等主要途径发挥作用。

通过GO富集筛选出的“黄芪-黄连”药对的106生物过程主要以蛋白质异二聚活性、DNA结合转录激活剂活性，RNA聚合酶II特异性、近端启动子序列特异性DNA结合、RNA聚合酶II近端启动子序列特异性DNA结合、染色质结合、泛素样蛋白连接酶结合等为主。通过KEGG富集筛选出的119条信号通路中的靶点富集的前几条通路中，基因数目主要集中在PI3K/Akt signaling pathway、hepatitis B、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、human cytomegalovirus infection、MAPK signaling pathway等信号通路。PI3K/Akt通路与代谢关系密切[37-38]，其广泛参与和调节合成糖原、脂肪、蛋白质，细胞的存活、增殖和代谢的过程[36]。“黄芪-黄连”药对的有效成分可通过直接作用于PI3K/Akt通路或通过雌激素受体等靶点激活AMPK和mTORC2，进而激活PI3K/Akt通路调节葡萄糖和脂质的代谢[39-41]，改善儿童肥胖。

分子对接显示，药对的主要活性成分同细胞有丝分裂、抑制炎症有较好的结合活性，表明“黄芪-黄连”药对通过影响细胞有丝分裂和抑制炎症反应影响儿童肥胖症的发展。

本文利用网络药理学和分子对接的技术方法，对“黄芪-黄连”药对治疗儿童肥胖症的可能作用机制进行了阐述，对其潜在的作用成分、作用靶点、关键生物学过程、关键通路和可能的分子成分进行了论述，为今后中医药治疗儿童肥胖症的研究提供思路。