三七红曲复方制剂遗传毒性评价

马 会，高 梅，李 雪，赵文静，英 永

（山东省药学科学院 山东省化学药物重点实验室，山东 济南 250101）

近年，中药及其复方的安全性越来越受到重视，特别是复方中药毒性复杂，一些不合理的配伍还会产生增毒作用或新的毒性物质[1]。三七红曲复方制剂是以三七和红曲粉为主要原料，经科学配方制成的一种调节血脂的保健食品。三七中含有活性成分三七总皂苷，被广泛用于心脑血管系统疾病[2-3]。红曲粉含有活性成分洛伐他汀，具有降血脂的药理作用[4-8]。由于红曲霉在发酵过程中可能产生桔霉素，而桔霉素被证实具有致畸性，因而使红曲的安全性受到关注[9]。目前三七和红曲的毒理学研究资料相对较少，更未见有红曲与三七配伍后复方的遗传毒性研究。因此，本研究参照食品安全国家标准GB 15193系列标准[10-12]及《保健食品及其原料安全性毒理学检验与评价技术指导原则》（2020年版）[13]对三七红曲复方制剂进行了Ames试验、小鼠骨髓细胞微核试验、小鼠睾丸染色体畸变试验，以评价其安全性，为临床使用提供重要参考依据。

1 材料

1.1 实验动物、菌株

动物：SPF级KM小鼠，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，体重28～33 g，6～7周龄，实验动物生产许可证号SCXK（京）2016-0011；动物饲养于SPF级饲养室，实验动物使用许可证号：SYXK（鲁）2018 0031，饲养室温度20～26 ℃，湿度40 %～70 %，昼夜明暗交替时间12 h/12 h。

菌株：鼠伤寒沙门菌TA97a、TA 98、TA100、TA102和TA1535，购自美国Moltox公司。

1.2 样品与试剂

三七红曲复方制剂（山东省药学科学院提供，批号为180901）；叠氮钠（山东西亚化学试剂有限公司，批号为S7470）；4-硝基喹啉-N-氧化物（Sigma-Aldrich公司，批号为WXBC7389V）；2-氨基芴（Sigma-Aldrich公司，批号为STBF2332V）；1,8-二羟基蒽醌（Sigma-Aldrich公司，批号为WXBB7902V）；环磷酰胺（Sigma-Aldrich公司，批号为C0768）；丝裂霉素C（Roche公司，批号为10107409001）。

1.3 仪器

HFsafe-1500TE生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司）；SPX-250B-Z生化培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；SSW-600-2S电热恒温水槽（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；LMQ.C立式灭菌器（山东新华医疗器械股份有限公司）；XK97-A菌落计数器（金坛市荣华仪器制造有限公司）；Nexcope生物显微镜（耐可视中国营业总部）；AUW120D电子分析天平（日本岛津有限公司）。

2 方法

2.1 Ames试验

在有和无代谢活化系统系统（±S9）条件下，采用标准平板掺入法进行试验。正式试验前，对所用菌株进行了组氨酸缺陷型鉴定、脂多糖屏障缺陷鉴定、uvrB修复缺陷型鉴定、R因子（抗氨苄青霉素）鉴定、四环素抗性鉴定、自发回变菌落数鉴定和阳性诱变剂敏感性鉴定，经鉴定合格。三七红曲复方制剂设5个剂量组，第一次试验剂量为5000，2500，1250，625，312.5 μg/皿，第二次试验剂量为5000，1000，200，40，8 μg/皿，两次均设置溶媒对照组和阳性对照组。在2 ml顶层培养基中，分别加入测试菌液0.1 ml、样品溶液0.1 ml（活化时再加S9混合液0.5 ml），混匀后迅速倒入底层培养基平皿内，转动平皿使顶层培养基均匀分布在底层培养基上，平放固化。将培养皿倒置于37±1 ℃培养48 h，观察结果。

2.2 小鼠骨髓细胞微核试验

将检疫合格的50只KM小鼠随机分为溶媒对照组（纯水）、三七红曲复方制剂低、中、高剂量组和阳性对照组（环磷酰胺，40 mg/kg），每组10只，雌雄各半。试验采用最大剂量法进行，低、中、高剂量分别设计为2，4，8 g/(kg·d)-1。各组均按照20 ml/kg体积灌胃给予相应溶液，每日1次，连续灌胃2 d，末次给药后6 h取胸骨制备骨髓涂片，甲醇固定、Gimesa染色后镜检，每只动物计数200个红细胞以确定嗜多染红细胞（PCE）占总红细胞（PCE+NCE）的比例，计数2000个嗜多染红细胞以测定有微核率嗜多染红细胞频率。

2.3 小鼠睾丸染色体畸变试验

将检疫合格的25只雄性KM小鼠随机分为溶媒对照组（纯水）、三七红曲复方制剂低、中、高剂量组和阳性对照组（环磷酰胺，40 mg/kg），每组5只。试验采用最大剂量法进行，低、中、高剂量分别为2，4，8 g/(kg·d)-1，给药容积为20 ml/kg，每日灌胃给药1次，连续5 d，各组动物在第14天腹腔注射秋水仙素（剂量为6 mg/kg）溶液，3～5 h后取两侧睾丸，经低渗、固定、离心、滴片制备标本。Gimesa染色后镜检，每个动物计数100个中期分裂相细胞，计算细胞畸变率。

2.4 数据统计

3 结果

3.1 Ames试验结果

在有和无代谢活化系统的条件下，5种菌株阳性对照组的回复突变菌落数均高于相应溶媒对照菌落数的两倍以上，有显著性差异（P≤0.05），表现出预期阳性结果。洪齐之康胶囊在5000，2500，1250，625，312.5 μg/皿剂量下和在5000，1000，200，40，8 μg/皿剂量下的回变菌落数与溶媒对照组比较均无显著性增加（P＞0.05），且无剂量反应关系，其中2500，5000 μg/皿剂量组的平皿有沉淀产生，但不影响计数。两次试验结果均表明该样品无诱导组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门菌基因突变作用。结果见表1、表2。

表1 Ames试验结果（第1次，±s，n=3）

表1 Ames试验结果（第1次，±s，n=3）

注：*P≤0.05 vs 溶媒对照组；①4-硝基喹啉-N-氧化物（0.5 μg/皿）；②叠氮钠（1.5 μg/皿）；③丝裂霉素C（0.5 μg/皿）；④2-氨基芴（10 μg/皿）；⑤1,8-二羟基蒽醌（50 μg/皿）；⑥环磷酰胺（200 μg/皿）

TA97a TA98 TA100 TA102 TA1535(-)S9 (+)S9 (-)S9 (+)S9 (-)S9 (+)S9 (-)S9 (+)S9 (-)S9 (+)S9溶媒对照组 153.7±11.7 174.3±178.0 25.0±2.6 28.3±7.6 148.3±22.5 166.7±22.3 213.3±9.3 280.3±27.0 15.7±3.1 13.3±7.6阳性对照组 370.3±43.1*①组别/μg·皿-1 283.7±19.8*⑥312.5 167.7±10.6 162.3±18.1 20.7±4.9 28.3±7.6 148.7±9.3 160.0±25.5 218.7±14.7 271.3±16.6 13.3±3.8 15.0±9.0 625 174.0±9.2 165.7±11.6 25.3±0.6 21.3±2.1 129.7±12.5 164.3±17.7 215.3±3.2 277.0±31.8 13.0±5.3 19.7±5.5 1250 153.3±13.9 167.7±9.0 22.0±3.5 22.0±1.0 141.3±30.9 152.7±27.1 209.3±11.0 275.3±14.3 10.7±1.2 12.3±4.2 2500 143.0±8.9 152.0±3.6 21.3±5.5 25.7±3.1 121.7±5.0 126.7±6.1 206.3±7.8 242.3±18.0 8.7±2.3 15.3±4.9 5000 150.3±11.0 154.67±8.0 20.0±4.4 21.0±2.0 135.0±12.8 148.7±14.7 209.3±5.9 260.0±16.5 9.0±2.0 14.0±3.6 2149.3±221.9*④386.7±32.3*①3248.0±304.0*④866.7±157.2*②1594.7±201.3*④1117.3±44.1*③1253.3±232.0*⑤816.0±213.3*②

表2 Ames试验结果（第2次，±s，n=3）

表2 Ames试验结果（第2次，±s，n=3）

注：同上

TA97a TA98 TA100 TA102 TA1535(-)S9 (+)S9 (-)S9 (+)S9 (-)S9 (+)S9 (-)S9 (+)S9 (-)S9 (+)S9溶媒对照组 160.3±9.8 153.7±9.2 20.3±1.2 22.3±2.1 137.0±19.5 160.7±20.3 229.7±4.0 247.0±17.1 13.7±2.1 17.3±1.5阳性对照组 397.3±99.9*①组别/μg·皿-1 285.0±24.8*⑥8 162.7±8.6 152.7±4.5 21.0±1.0 23.0±2.0 143.0±18.5 157.7±16.2 223.7±8.5 243.7±12.9 12.0±2.6 15.0±1.0 40 146.3±10.2 157.0±7.5 21.0±3.0 21.7±0.6 131.7±21.0 160.7±17.6 216.7±16.0 253.3±8.0 12.3±1.5 13.0±3.0 200 160.3±7.6 163.0±7.9 25.0±2.6 22.7±3.8 131.7±7.1 160.0±19.5 213.7±12.9 247.3±10.2 13.0±1.7 16.0±4.4 1000 137.7±20.2 156.3±16.6 23.7±3.2 25.0±3.6 161.0±4.6 154.0±17.0 222.0±5.2 233.7±15.4 11.7±1.5 14.7±5.7 5000 135.7±10.4 142.3±10.6 22.0±3.6 23.0±4.4 147.7±6.1 154.0±11.3 222.7±20.6 240.7±11.5 11.7±3.1 13.3±4.2 504.0±25.0*④284.3±37.2*①3355.3±522.3*④1496.0±81.2*②1869.3±473.6*④1045.3±128.3*③1333.3±124.3*⑤973.3±275.1*②

3.2 小鼠骨髓细胞微核试验结果

阳性对照组的PCE/（PCE+NCE）比值与溶媒对照组比较无统计学差异（P＞0.05），微核率有显著统计学差异（P≤0.05），说明试验系统可靠。三七红曲复方制剂各剂量组的PCE/（PCE+NCE）比值和微核率与溶媒对照组比较无统计学差异（P＞0.05），未见骨髓细胞抑制毒性诱导微核升高的作用，试验结果为阴性。结果见表3。

表3 小鼠骨髓微核试验结果（±s，n=5）

注：*P≤0.05 vs 溶媒对照组；PCE：嗜多染红细胞；NCE：正染红细胞。

组别 剂量/g·kg-1 微核率/ ‰ PCE/（PCE+NCE）雌性 雄性 雌性 雄性溶媒对照组 / 2.19±0.84 1.99±0.71 0.64±0.05 0.69±0.06低剂量组 2 2.08±0.42 1.88±0.70 0.68±0.03 0.63±0.02中剂量组 4 2.16±0.87 2.58±0.94 0.67±0.05 0.64±0.05高剂量组 8 1.99±0.61 1.89±0.42 0.66±0.04 0.70±0.07阳性对照组 0.04 18.08±4.13* 19.14±1.70* 0.62±0.04 0.64±0.13

3.3 小鼠睾丸染色体畸变试验结果

与溶媒对照组比较，阳性对照组的断裂、缺失、相互易位、有着丝点环状染色体、单价体、细胞畸变率均有统计学差异（P＜0.05），三七红曲复方制剂各剂量组的断裂、缺失、相互易位、环状染色体、单价体、细胞畸变率均无统计学差异（P＞0.05），试验结果为阴性，结果见表4。

表4 小鼠睾丸染色体畸变试验结果（±s，n=5）

表4 小鼠睾丸染色体畸变试验结果（±s，n=5）

注：*P≤0.05 vs 溶媒对照组

组别 溶媒对照组 低剂量组中剂量组高剂量组 阳性对照组剂量/g·kg-1 / 2 4 8 0.04动物只数 5 5 5 5 5观察细胞数目 500 500 500 500 500畸变率/% 1.80±0.45 1.80±0.84 2.00±0.71 2.20±1.30 12.80±3.11*畸变类型断裂 3 2 1 6 18*缺失 1 1 1 2 7*有着丝点环 1 2 1 2 8*无着丝点环 0 0 1 0 1微小体 2 2 3 0 0非特定型变化 2 0 0 1 1相互易位 0 2 3 0 31*裂隙 2 1 6 2 8性染色体单价体 2 3 3 7 13*常染色体单价体 1 0 2 2 12*

4 讨论

三七红曲复方制剂是由三七和红曲组成的复方中药，其作用机制及成分间的相互作用较复杂，且红曲中可能会伴有毒性杂质——桔霉素，增加用药风险。三七作为传统药材，其遗传毒理学资料多为活性成分的研究，结果均为无潜在的遗传毒性[14-16]。红曲的毒性研究多关注在桔霉素的影响，有文献报道[17-18]，并不是所有的红曲菌株均产生桔霉素，即使产生也仅在发酵晚期。此外，红曲的毒性研究文献表明未见其有遗传毒性作用[19-20]。为充分考察三七红曲复方制剂是否具有遗传毒性，本研究选择遗传毒性组合试验进行，包括Ames试验、骨髓细胞微核试验、睾丸染色体畸变试验。Ames试验是应用最广泛的检测基因突变的体外试验，具有快速、方便、灵敏性好等特点[21]。骨髓细胞微核试验可检测染色体或有丝分裂是否受到损伤，是评价哺乳动物体细胞遗传毒性的细胞水平手段，睾丸染色体畸变试验是从染色体水平评价生殖细胞遗传突变的可能性[22-23]。

参照《保健食品及其原料安全性毒理学检验与评价技术指导原则》（2020年版）和食品安全国家标准[10-13]，Ames试验采用推荐的最高剂量5 mg/皿，在首次试验的312.5～5000 μg/皿剂量范围内和重复试验的8～5000 μg/皿剂量范围内均未发现受试菌株的回复突变菌落数有剂量依赖性增加，判定结果为阴性。小鼠骨髓细胞微核试验和小鼠睾丸染色体畸变试验均采用最大灌胃剂量法，受试样品在2～8 g/kg剂量范围内对小鼠骨髓嗜多染红细胞的微核率和睾丸染色体的形态变化无明显影响。以上结果表明三七红曲复方制剂无诱发基因突变及染色体损伤的作用。

综上，在本试验条件下，三七红曲复方制剂作为保健食品无潜在的遗传毒性。