噬菌体对鸡肠炎沙门氏菌的防治研究

吕兴帮，郝 贺，张 博，张永英，石玉祥，钟翠红

（河北工程大学生命科学与食品工程学院，河北 邯郸 056000）

肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis）可感染人和动物[1]。肠炎沙门氏菌是食源性疾病暴发的主要原因，感染后的畜禽可将细菌传至其制品，与其他食物交叉感染造成食源性疾病传播[2]。抗生素是主要的抗菌药物，但因抗生素广泛使用，细菌的耐药性正逐渐显现[1]。在全球替抗的背景下，开发新型抗菌药物成为热点研究方向。

噬菌体是细菌的天然杀手，数量丰富、分布广泛。噬菌体侵入细菌体内进行自身繁殖，通过释放酶类物质裂解细菌，释放子代噬菌体。因抗生素耐药特异性与细菌互作性在多数细菌物种中的发展传播，噬菌体疗法再次受到人们的关注[3]，并应用于动物和人类的食源性、环境病原体的生物控制。对噬菌体生物学和遗传学的深入研究，有助于探索噬菌体的进化规律并更好地解释其与宿主细菌相互作用的分子机制。

1 肠炎沙门氏菌危害及耐药性发展

欧美等国的食源性疾病多数由肠炎沙门氏菌引起，常造成数以千亿的损失。据调查，仅在美国，肠道沙门氏菌每年引发约100 万例食源性疾病[3]；欧盟成员国每年感染沙门氏菌病的患者约10～16万人，沙门氏菌的发病率与蛋鸡中存在的肠炎沙门氏菌显著相关，表明鸡蛋可能是引发人类疾病的主要感染源[4-5]。2012 年，Hulaj 等[6]对科索沃地区的39 个蛋鸡养殖场进行抽样检测，发现49%的样本中均存在沙门氏菌感染，占比最高的血清型是肠炎沙门氏菌；对所分离菌株的耐药性分析显示，所有菌株均对庆大霉素、氨苄西林、磺胺甲恶唑、土霉素敏感，其中29 株（97%）对环丙沙星敏感；所有菌株对二甲胺四环素和邻氯青霉素均表现中度耐药或耐药，26株（86%）对阿莫西林中度耐药，27 株（90%）对链霉素完全耐药。Wei 等[7]对我国贵州省2011～2016年间发生的食源性疾病病例进行病原菌分离，对分离得到的16株临床菌株进行检测，发现所有菌株至少对一种抗生素耐药性，耐药率最高的是萘啶酸（98.7%），多数分离株（92.4%）对环丙沙星的敏感性降低，同时观察到细菌对第3、4代头孢菌素耐药。肠炎沙门氏菌已在世界范围内广泛传播，抗生素可诱发细菌耐药性产生，并且可对公共卫生造成危害。因此，研发新型抗菌药物对当前的家禽养殖具有重要意义。

2 噬菌体及其产物

噬菌体是一种细菌病毒，由蛋白外壳和内部核酸构成，须寄生在活菌内才可完成复制增殖。1982 年，国际病毒分类委员会规范了噬菌体的分类标准[8]，可根据蛋白质结构分为有尾噬菌体、无尾噬菌体和丝状噬菌体。其中，有尾噬菌体数量最多，常见的T系烈性噬菌体均属有尾噬菌体；根据其核酸类型，可分为DNA或RNA[9]，大体上细分为ssDNA、dsDNA、ssRNA、dsRNA；根据其作用特点，可分为烈性噬菌体和温和性噬菌体。烈性噬菌体可直接侵入细菌，在细菌内部完成增殖并裂解宿主菌；温和性噬菌体通过核酸整合，随宿主菌共同分裂增殖，在特定的情况下裂解细胞。

噬菌体对靶细菌的裂解主要依靠自身产物-裂解酶。在裂解周期中，噬菌体在细菌宿主体内表达其裂解基因，形成水解细菌细胞壁的裂解酶。裂解酶本质是蛋白质，与完整的噬菌体相比，可能更具有安全性[10]。裂解酶可直接作用于细菌，无需经历噬菌体的侵袭过程，但裂解酶的常规制备方法复杂，不适宜大规模生产。因此，通常使用基因重组技术制备大量目的蛋白。此外，基因重组也能够优化裂解酶的作用特性，利用重组技术扩大裂解酶的裂解谱，进而增强裂解效果。

3 噬菌体侵染细菌的途径

噬菌体侵染细菌的途径即是裂解周期，包括吸附、核酸注射、病毒粒子组装以及子代病毒的释放。

（1）吸附：是噬菌体生命周期的关键步骤之一，需要细菌包膜上的宿主表面蛋白、脂多糖或其他分子（磷壁酸、菌毛、鞭毛）的特异性识别。细菌表面受体识别导致噬菌体粘附于细菌，允许渗透细菌包膜及注射病毒遗传物质。

噬菌体吸附通常包括初始接触、可逆结合和不可逆附着。初始接触涉及由布朗运动、分散、扩散或流动引起的噬菌体和宿主之间的随机碰撞，表明噬菌体与细菌结合需要一定的数量关系；在可逆结合中，噬菌体与细菌表面成分的结合不是决定性的，噬菌体可从宿主中解吸，这一过程由Garen 等[11]噬菌体洗脱分离试验确定；在不可逆结合中，噬菌体与细菌受体的结构域之间进行特异性连接，为之后的核酸注射创造条件。

（2）核酸注射：噬菌体将其核酸注射至细菌内部需要一些裂解酶质参与。噬菌体依靠其自身的裂解酶可裂解细菌细胞壁的肽聚糖，将自身核酸注入细胞。噬菌体的核酸接管细菌的合成系统，通过基因表达以合成噬菌体所需的核酸和蛋白质[12]。

（3）病毒粒子组装：噬菌体基因组指导宿主细胞合成相应的结构蛋白和子代病毒核酸，核酸经由机构蛋白包裹，形成头部-尾丝及尾部的其他部件，头尾结合，连接尾丝，组装得到1个形状和大小相同的成熟噬菌体。

（4）子代病毒释放：子代噬菌体组装完成，由胞内转移到胞外，再次侵染宿主细胞，开始新一轮的复制周期。烈性噬菌体以溶解细胞的形式释放，通常一个噬菌体经过一轮裂解周期，可产生100～300个子代噬菌体。温和性噬菌体通常随宿主细胞进行同步遗传复制，这一过程不会裂解宿主细胞。

4 噬菌体于肠炎沙门氏菌的应用进展

噬菌体的发展历史久远，但应用条件较为苛刻，需要与靶细菌进行特异性识别；且噬菌体进入体内的作用机制尚未得到完全阐释，可能对机体存在潜在威胁。目前，噬菌体重获关注，噬菌体的研究与发展得到极大推动，应用涉及多个领域，如疾病防控、环境消毒以及细菌检测。

4.1 噬菌体的防控效果

有研究表明，家禽长期使用噬菌体在减少寄生在消化道的沙门氏菌病原体数量方面具有良好效果。王曦等[13]通过粪便移植与噬菌体联合治疗，降低了经沙门氏菌感染的雏鸡死亡率，缓解了雏鸡肠道炎症损伤。Ahmadi等[14]在攻毒前对鹌鹑进行噬菌体灌胃，发现噬菌体可降低体内肠炎沙门氏菌的数量。Wernicki 等[15]研究发现，通过气溶胶喷雾消毒和口服接种噬菌体均可减弱肠炎沙门氏菌对肉鸡的感染。肠炎沙门氏菌可通过垂直传播。因此，被多重耐药菌污染的鸡蛋也是危害人类健康和公共卫生安全的潜在隐患。Sonalika等[16]将鸡蛋浸泡在菌液中进行细菌接种，发现在鸡蛋表面施用噬菌体可使鸡蛋表面的细菌数量减少2×106CFU/mL。

4.2 噬菌体的消毒作用

与抗生素相比，噬菌体对环境几乎没有损害，可考虑使用噬菌体作为环境消毒剂。于晓妍等[17]研究显示，经大肠杆菌噬菌体喷雾30 min，鸡舍内消毒区域的细菌数量比对照组低99%。钱新杰等[18]以大肠杆菌噬菌体对地面细菌进行喷雾消毒，结果表明，与对照组相比，经噬菌体PNJ1809-11 处理的地面残留菌落数量下降约2.5 个数量级，AB9杀灭效率为99.32%；经噬菌体PNJ1809-13处理的地面菌落数量下降约1个数量级，杀灭效率为91.23%。综上所述，噬菌体具有作为消毒剂的潜力，可为家禽生产中的沙门氏菌提供新的消毒策略。

4.3 噬菌体的检测技术

噬菌体因对宿主高度敏感和特异性应用于细菌的检测。有些测定方法利用噬菌体裂解检测细菌的胞内成分，或以此产生的环境变化为细菌存在标记；其他方法则通过检测噬菌体的繁殖情况，作为目标细菌的存在信号[19]。

Garrido 等[20]研究表明，建立沙门氏菌噬菌体B_SenS_PVP-SE2 扩增与qPCR 结合的方法检测鸡样本，可检测到低浓度的活菌，节省了大量时间，提高灵敏度和准确性。随着分子生物学技术发展，基因工程噬菌体已成为监测和检测细菌病原体的有力工具。这种技术可应用于检测污染食品中的细菌，具有较高的选择性和灵敏度[21]。Kim等[22]采用完整的luxABCDE操纵子检测不同食物基质中的沙门氏菌。此方法还可应用于沙门氏菌的诊断和快速检测。Choi 等[23]利用较高特异性及稳定性的KFS-SE2 噬菌体作为生物传感器的生物受体。此方法也可快速且准确地检测农产品上的肠炎沙门氏菌。

5 噬菌体的应用前景

5.1 噬菌体应用的优势

（1）高度特异性：噬菌体因具有高度特异性成为替抗药物。但与抗生素广谱杀菌不同，噬菌体只靶向作用于肠道中特定的病原菌，对其他菌株无裂解作用，不会破坏区域中的其他微生菌群[24]。噬菌体只在宿主菌中增殖分裂，噬菌体的所有宿主被裂解，噬菌体会被自动清除。

（2）高效性：噬菌体借助宿主细菌代谢系统实现自我维持。噬菌体药物动力学表明，噬菌体经历1个感染周期可产生200 个子代噬菌体，当完成4 个感染周期，1 个噬菌体颗粒可产生数十亿个子代噬菌体。因此，小剂量的噬菌体制剂即可清除宿主细菌，而抗生素往往需要多次用药，维持在一定浓度才能达到预期治疗效果[25-26]。

（3）适应性：抗生素的杀菌成分相对固定，无法应对细菌的持续进化，治疗耐药菌存在一定的局限性。噬菌体作为一种活体微生物，可以同细菌共同进化，并且还可以适应抗性菌株，防止耐药菌的生物膜形成或清除预先形成的生物膜[27]。

5.2 噬菌体应用的局限性

（1）作用机制尚不明确：噬菌体和细菌之间的分子机制以及噬菌体在体内的行为仍不完全明晰。噬菌体可在宿主体内繁殖，根据所处环境的变化，也可能发生变异。这种变异结果无法判断。噬菌体药动学和药效学仍需进一步探索。因此，治疗各种类型感染的噬菌体产品的最佳剂型尚未确定。

（2）免疫原性：基于病毒的生物学特性，尽管噬菌体不会感染人类细胞，但宿主的免疫系统可能会产生针对噬菌体的抗体，在噬菌体未作用细菌前将其清除。梁梅等[28]对噬菌体进行免疫原性试验，结果表明，与对照组相比，噬菌体组中的小鼠血清可产生针对噬菌体的抗体，表明噬菌体具有一定免疫原性，可刺激机体产生中和抗体，这是噬菌体用药需要克服的关键问题[29]。

（3）传播耐药基因：耐药基因通常存在于各种可移动基因元件（MGE）当中，如质粒、基因组岛和转座子，而水平基因转移机制是食源性细菌病原体的抗生素抗性传播增加的原因之一[30]。环境中的噬菌体（如污水、海洋、土壤）携带大量抗生素抗性基因ARGs，噬菌体可通过转导作用将ARGs转移至宿主细菌。上述结果表明，噬菌体在与细菌相互进化的过程中，具有转移遗传物质的潜力，并且可能在抗生素耐药传播中发挥积极作用。因此，不应低估噬菌体对环耐药基因的传播[31]。

6 展望

肠炎沙门氏菌作为重要的食源性病原菌之一，对畜禽生产及人类生活具有重要的防护意义。噬菌体可特异性杀灭肠炎沙门氏菌并中断其流行传播，噬菌体分离的蛋白质具有巨大的医疗潜力，可应用于环境消毒、食品保存、癌症治疗、疫苗开发、生物传感装置、治疗基因和抗菌剂的靶向递送等方面。但是，具体的作用机制仍未完全明晰。随着科学的发展进步，噬菌体将作为一种生物制剂应用于畜禽甚至整个养殖业的生产防控，噬菌体技术的成熟与完善将对医疗产生重要的推动作用。