1 株产蛋白酶菌株的分离鉴定及其产酶条件的优化

卢丽媛，周丽艳，宋天悦，马子豪，申青忠，周雪雁

（西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730124）

蛋白酶是微生物产生的主要酶，广泛应用于食品、诊断试剂、皮革、药物及护肤品等领域[1]。Lillian 等[2]筛选得到的BF20菌株具有溶栓能力；李奇[3]分离的沙蚕蛋白酶具有疏通血管的作用。这些蛋白酶均可有效地降解纤维蛋白原，在健康等领域具有很大的利用价值，且相对其他药物更安全经济。蛋白酶对废弃物的降解具有一定的优势，这种微生物降解方式相对于常规垃圾物的焚烧、深埋处理方式，可显著缓解对环境的污染程度。张妮等[4]在废弃物中获得1株名为Gxun-30的菌株，其所产的角蛋白酶在最适产酶条件下几乎可以使整根羽毛完全降解，该酶在酪蛋白肽和医学用胶原材料的制备等领域同样具有应用价值。Tang等[5]从海水中分离的产蛋白酶细菌，可降解海洋中的有关物质。蛋白酶还可缩短污泥的发酵周期[6]。近年来，我国蛋白酶的使用遍及各大产业[7]，尤其是微生物源碱性蛋白酶具有不可替代的作用，始终占据酶市场中的主导地位，约占洗涤剂产业的50%[8-10]。

本试验得到1 株芽孢杆菌，来自甘肃省甘南地区夏河县的土壤，鉴定其为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）。苏云金芽孢杆菌虽为重要的微生物源蛋白酶，但国内外却少见有关其应用于工业蛋白酶生产的报道。本试验采用单因素试验设计优化苏云金芽孢杆菌生产碱性蛋白酶条件，以期最大限度利用苏云金芽孢杆菌生产碱性蛋白酶。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验样品

样品采集于甘肃省夏河地区深度20～30 m处的土样。

1.1.2 培养基

LB 液体培养基：酵母粉5 g/L、胰化蛋白胨10 g/L、氯化钠10 g/L。酪素培养基：KH2PO43.6 g、MgSO4·7H2O 5 g、ZnCl20.14 g、Na2HPO4·7H2O 10.7 g、NaCl 1.6 g、CaCl20.02 g、FeSO40.02 g、Trypticase 2 g、酪 素4 g、琼 脂20 g/15 g、pH值6.5～7.0。液体发酵培养基：玉米粉40 g/L、豆粕粉30 g/L、Na2HPO44 g/L、KH2PO40.3 g/L。

1.1.3 试验试剂

酵母提取粉、氯化钠、胰化蛋白胨（OXOID 公司），琼脂（北京索莱宝生物科技有限公司），NaOH（分析纯，天津市大茂化学试剂厂），血清（兰州民海生物工程有限公司），革兰染色试剂（博精索拉博科技有限公司），细菌生化鉴定管（杭州微生物试剂有限公司），福林酚试剂（分析纯，博精索拉博科技有限公司），干酪素（阿拉丁工业公司）。

1.1.4 仪器设备

YXQ-LS立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯医疗生物仪器股份有限公司）、DHG-9146A 电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏试验设备有限公司）、MOST-T蒸汽灭菌器（山东新华医疗器械股份有限公司）、AR224CN 电子天平（奥豪斯仪器常州有限公司）；IS-ROV1 立式恒温振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）、13395H2XBME 显微镜（莱卡）、SW-CJ-1F 洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）、Pico17 高速离心机（BioRad）、电泳仪（北京六一仪器设备）、微波炉（广东格兰仕）。

1.2 试验方法

1.2.1 产蛋白酶菌株筛选与纯化

使用灭菌蒸馏水稀释少量样品，梯度分别为10-1、10-2、10-3、10-4。取10-4土壤稀释液200µL，均匀涂布于酪素固体培养基表面，37 ℃恒温培养24 h。挑取分离平板培养基上透明水解圈直径大小与菌落直径大小之比大的菌落，并在酪素培养基上三区划线进行菌株的纯化，放入恒温箱，操作重复3次。将纯化后的单菌落点种于酪素固体培养基上，37 ℃保存24 h，再次根据菌落水解圈与菌落之比，初步筛选高产蛋白酶菌株。

1.2.2 菌株形态学鉴定

挑取已纯化的单菌落菌株三区划线，恒温培养24 h，肉眼观察该菌株的菌落特点，挑取目标菌株革兰氏染色并涂片，光学显微镜下观察细菌形态与特征。

1.2.3 生理生化鉴定

挑取目标菌株放入LB 液体培养基，摇床振荡培养24 h，摇床温度设置为37 ℃、转速为180 r/min。以每管50µL 的量接种于生化管中，生化指标包括VP 试验、甲基红试验、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、明胶液化、淀粉水解等。根据说明书要求，对生化管进行接种培养，观察并记录各管结果，绘制生化图谱。

1.2.4 分子生物学鉴定

挑取目标菌株至LB液体培养基，37 ℃180 r/min的摇床中振荡培养10 h，制得细菌培养液。使用1.5 mL离心管收集细菌培养液0.5 mL，12 000 r/min离心2 min，弃去上清液。使用快速提取试剂盒，提取菌株NWMCC0320基因组的DNA。

采用16S rRNA全长引物合成27F:5'-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3'，1492R：5'GGTTACCTTGTTACGACT T-3'，扩增细菌核糖体16S rDNA。

PCR 扩增条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30个循环；72 ℃继续延伸10 min，4 ℃保存。得到相应的PCR 产物。产物送至上海生工生物工程股份有限公司测序，获得16S rDNA 序列。将所得序列上传至数据库GenBank，利用BLASTN程序对测序所得16S rDNA 序列进行同源性的比对，利用MEGA7.0软件构建相应的系统进化树[11]。

1.2.5 蛋白酶活力测定

于pH 值为9 液体发酵培养基中接种菌株的单菌落，37 ℃180 r/min的摇床中培养48 h，梯度离心发酵液备用。蛋白酶活力测定按照国标QB 747—80方法进行测定[12-13]。比较蛋白酶的产酶活力，以高产菌株作为目标菌株。

1.3 产蛋白酶的优化培养

1.3.1 粗酶液的制备

于液体发酵培养基中（pH 值自然）接种菌株的单菌落，37 ℃180 r/min摇床中培养10 h，制得种子液。

1.3.2 温度对产蛋白酶的影响

将种子液（接种量为5%）接种于容量为50 mL的液体发酵培养基中，设置温度梯度为25、30、35、40、45、50 ℃，放入180 r/min的摇床中培养24 h，分别测定其产蛋白酶的活力。

1.3.3 初始pH值对产蛋白酶的影响

加入相同pH值的磷酸缓冲液分别调配液体发酵培养基的初始pH 值，设置pH 值梯度为5.5、6.5、7.5、8.5、9.0。调整好50 mL液体发酵培养基的pH值，将种子液按照5%的接种量接入。同上优化结果，180 r/min 摇床培养24 h，分别测定其产蛋白酶的活力。

1.3.4 氮源种类对产蛋白酶的影响

将4种不同的氮源（硝酸钾、硫酸铵、蛋白胨、尿素），以浓度30 g/L 取代发酵培养基中的豆粕粉（30 g/L），接种至另一新的液体发酵培养基中（接种量为5%）。温度、pH值同上的优化结果，置于180 r/min 摇床中培养24 h，分别测定其产蛋白酶的活力，所得结果则为该菌株产蛋白酶的最佳氮源种类。接着在液体发酵培养基中，分别以10、20、30、40、50 g/L 的终浓度添加最佳氮源。同上优化结果，180 r/min摇床培养24 h，分别测定其产蛋白酶的活力。

1.3.5 碳源种类对产蛋白酶的影响

5种碳源（葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、柠檬酸钠）分别以浓度40 g/L 取代发酵培养基中的玉米粉（40 g/L），并接种至另一新的液体发酵培养基中（接种量为5%）。温度、pH值同上的优化结果，放入180 r/min的摇床中培养24 h，分别测定其产蛋白酶的活力，结果即为测定所得最佳碳源；在液体发酵培养基中，分别以10、20、30、40、50 g/L 的终浓度添加最佳碳源，同上优化结果，放入180 r/min 的摇床中培养24 h，分别测定其产蛋白酶的活力。

1.4 酶学性质的探究

1.4.1 温度对蛋白酶活性的影响

设置水浴锅的温度为：25、30、35、40、45、50 ℃。取1 mL 经适度稀释的粗酶液，与1 mL 的酪蛋白（pH 值9）一同水浴。10 min后，分别测定其产酶活力。蛋白酶活力测定依据国标QB 747—80。

1.4.2 pH值对蛋白酶活性的影响

在上述最适条件下，使用不同pH 值的磷酸缓冲液进行稀释。适当将磷酸缓冲液滴入，使粗酶液pH 值为5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5。取稀释液1 mL，与1 mL 相应pH 值的酪蛋白在最适温度条件下水浴反应10 min，蛋白酶活力测定依据国标QB 747—80。

2 结果与分析

2.1 产蛋白酶菌株的筛选

试验纯化得到了4株菌株。通过点种法在酪素培养基上接种，所得4株菌的透明水解圈与菌落直径比值结果见图1、表1。

由图1、表1 可知，NWMCC0320 菌株的比值最大，说明该菌株在酪蛋白平板上活性最高。使用福林酚法分别测定其产蛋白酶活力，对菌株进行进一步筛选，结果见图2。

表1 菌株透明水解圈与菌落直径比值Tab.1 Ratio of transparent hydrolysis circle to colony diameter

图1 目标菌株NWMCC0320透明水解圈Fig.1 Transparent hydrolysis circle of target strain NWMCC0320

由图2 可知，NWMCC0320 菌株酶活力显著高于其他菌株，初步测定蛋白酶活力为114.21 U/mL，即将NWMCC0320菌株作为目标菌株应用于后续的试验。

图2 蛋白酶活力Fig.2 Protease activity

2.2 菌株形态学鉴定

NWMCC0320 菌株形态学特征表现为：菌落圆形、颜色呈乳白色、大小中等，表面隆起、易挑起、不透明、边缘不整齐。革兰氏染色镜下观察，目标菌株颜色为蓝色，可知其为革兰氏阳性菌，形状呈杆状、两端钝圆，菌体长3.0～5.0µm，宽1.2～1.8µm，有呈椭圆形的芽孢产生，细菌为好氧菌。

2.3 NWMCC0320菌株生理生化鉴定结果（见表2）

由表2 可知，NWMCC0320 菌株可发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，但不能发酵木糖、阿拉伯糖、纤维二糖及部分醇类；NWMCC0320菌株能够利用葡萄糖作碳源。

表2 NWMCC0320菌株生化鉴定结果Tab.2 Biochemical identification results of NWMCC0320 strain

在吲哚试验中，甲基红表现为弱阳性，VP 试验呈阳性。此外，该菌株能够还原硝酸盐，具有液化明胶和水解淀粉的能力，精氨酸脱羧酶呈阳性。

2.4 NWMCC0320菌株分子生物学鉴定（见图3）

目标菌株所提基因组DNA 经电泳检测，该菌株核酸序列全长约为1 500 bp，扩增细菌核糖体16S rDNA，得到相应的PCR 产物。利用BLASTN 程序对测序所得16S rDNA序列进行同源性的比对。

由 图 3 可 知，NWMCC0320 菌 株 与Bacillus thuringiensisIAM 12077菌株的序列相似性为100%。

图3 基于16S rRNA基因序列建立的NWMCC0320菌株系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of NWMCC0320 strain based on 16S rRNA gene sequences

2.5 NWMCC0320菌株最适产酶条件的测定

2.5.1 酶活标准曲线（见图4）

分别以吸光度值、酪氨酸浓度值作为横、纵坐标，绘制相应标准曲线。由图4可知，该菌株产蛋白酶活力标准曲线的回归方程为y=0.01x+0.001 7，R²=0.999 6。当光密度为1时，计算与之相当的酪氨酸质量K=99.83。

图4 酶活标准曲线Fig.4 Standard curve of enzyme activity

2.5.2 最适产蛋白酶温度（见图5）

图5 最适产蛋白酶温度Fig.5 Optimum temperature for protease production

由图5可知，目标菌体的产蛋白酶活力随温度而升高，35 ℃时产酶活力达到峰值，35 ℃后随温度升高呈递减趋势，50 ℃时酶活降至31.09%。

2.5.3 最适产蛋白酶pH值（见图6）

图6 最适产蛋白酶pH值Fig.6 Optimum pH value for protease production

由图6 可知，pH 值为5.5 时，该菌体相对酶活低于50%；随着pH值递增，菌体产蛋白酶活力明显增强，pH值8.5 时酶活力最大，菌体在pH 值9.5～10.5 的区间内仍具有很高的产酶活力。

2.5.4 产蛋白酶最适氮源（见图7）

由图7可知，有机、无机氮源均可被菌株利用，但是菌株极少利用无机氮源。相对其他氮源，目标菌株对蛋白胨的利用率最高。

图7 产蛋白酶最适氮源Fig.7 Optimum nitrogen source for protease production

2.5.5 产蛋白酶最适氮源浓度（见图8）

由图8 可知，在氮源浓度分别为10、20、30、40、50 g/L的条件下，目标菌株的产酶活力呈先增后减的趋势；浓度为30 g/L时最高。

图8 产蛋白酶最适氮源浓度Fig.8 Optimum nitrogen concentration for protease production

2.5.6 产蛋白酶最适碳源（见图9）

由图9 可知，碳源为葡萄糖时，菌株产蛋白酶活力最高；与其他碳源相比，目标菌株对葡萄糖的利用率最高。

图9 产蛋白酶最适碳源Fig.9 Optimal carbon source for protease production

2.5.7 产蛋白酶最适碳源浓度（见图10）

图10 产蛋白酶最适碳源浓度Fig.10 Optimum carbon source concentration for protease production

葡萄糖为碳源时，目标菌株产酶活性较高。由图10可知，在碳源浓度分别为10、20、30、40、50 g/L 的条件下，目标菌株的产酶活力先增后减，浓度为20 g/L时达到峰值。

2.6 酶学性质分析

2.6.1 蛋白酶最适温度（见图11）

由图11可知，蛋白酶的活性会受到温度影响而发生显著变化。在温度分别为25、30、35、40、45、50 ℃的条件下，蛋白酶的酶活逐渐增高。蛋白酶的活性在温度为25 ℃的条件下为最低，温度为50 ℃的条件下达到最大，可推测其局部活性可能因温度过低而受到抑制，表明该菌株耐高温，酶解效率受温度高低的影响。

图11 蛋白酶最适温度Fig.11 Optimum temperature of protease

2.6.2 蛋白酶最适pH值（见图12）

由图12 可知，蛋白酶的活性受pH 值影响而发生显著变化，随着pH值加大，酶活呈现先增后减的趋势。当酶活性达到最大时，pH值为9.5，表明pH值可影响酶解效率；当pH 值在5.5～6.5 的范围内时，该蛋白酶活性的相对酶活均低于50%，说明该酶对酸的敏感性相对较高，可推测其具有不耐酸的特性。

图12 蛋白酶最适pH值Fig.12 Optimum pH of protease

在碱性条件下（pH值为10.5），蛋白酶仍表现较高的酶活性（活性高于70%），表明该菌体所产蛋白酶活性对碱性具有耐受作用，可推测该酶相对嗜碱。

3 讨论

菌株NWMCC0320的生理生化试验特征，参考罗杰氏细菌鉴定手册中有关苏云金芽孢杆菌的内容，可知该目标菌株的生化图谱与之相符。菌株NWMCC0320 与苏云金芽孢杆菌之间存在较近的关系，在16S rRNA 序列系统进化分析中显示，NWMCC0320 菌株与Bacillus thuringiensisIAM 12077 菌株的序列相似性为100%。根据菌株NWMCC0320 在形态学上结合生理生化试验结果中所呈现的特征，可鉴定其为苏云金芽孢杆菌。

本试验中，温度高于35 ℃时酶活降低，推测是因为温度过高，酶活性降低甚至失活，导致细菌生长代谢受阻、无法持续生长繁殖，蛋白酶合成受阻，酶活大幅度降低。pH值为5.5时，该菌体相对酶活低于50%，说明极酸性条件下并不适合产酶，随着pH值的递增，菌体产蛋白酶活力明显升高，在pH值为8.5时酶活力最大，而菌体在pH值9.5～10.5的区间内仍然具有很高的产酶活力，表明该产蛋白酶菌可在一定程度上耐碱。

微生物的生长与繁殖需要氮源作为原材料。在微生物合成细胞过程中，氮源主要供给含氮物质。其中，蛋白胨作为有机氮源，氨基酸含量十分丰富，还含有生长素和其他生长因子，可供细菌生长所需。本试验中，随着蛋白胨浓度的增加，目标菌株产蛋白酶活力随之下降，原因可能为细菌代谢的失衡，致使菌株产酶活力下降。菌种的生长、繁殖、合成、代谢等状态由相应的碳源维持，碳源主要是供给微生物能量。此外，菌株的代谢产物与菌体的有关细胞成分，碳源也有参与构成。碳源浓度为1%时，产蛋白酶活力受到少部分抑制，可能是菌株所需的碳源的量不足，无法供给菌种足够的能量。当终浓度为50 g/L 时，相对酶活降至50%以下，可能是因为碳源浓度过大，反而抑制了菌株产蛋白酶，从而导致酶活下降。

Bacillus thuringiensis是一种重要的微生物源蛋白酶。黄慧敏等[14]分离的苏云金芽孢杆菌可产生某种特殊的晶体，可作为常用的微生物源杀虫剂，能够杀灭不同种类的昆虫，且对环境友好，对人体无危害。赵谋明等[15]分离得到一株SWJS07 经过优化培养，蛋白酶活可最大限度地提高30%以上。Zhang等[16]分离出一株Bacillus thuringiensis菌株，为高产碱性蛋白酶菌株。

现已从许多微生物中分离纯化得到多种碱性蛋白酶，但应用于生产高活性碱性蛋白酶的微生物依然只占少数。为满足各种工业对碱性蛋白酶的需求，还应探索更多新的蛋白酶高产菌株[17]。苏云金芽孢杆菌与其所产生的蛋白酶，究竟能否用于工业生产，还有待进一步研究。

对于本文筛选的菌株，后期研究工作重点为进一步提高Bacillus thuringiensis的产酶性能，并探究该菌株在饲料工业中的应用价值。

4 结论

本试验从甘肃甘南土壤中分离出1 株芽孢杆菌，通过对其16S rRNA 的序列进行鉴定，可知该菌株为Bacillus thuringiensis。该菌株最优产蛋白酶条件为：温度50 ℃、pH值9.5，该酶表现较高的产蛋白酶活性。经过优化试验，该菌株的最适反应条件为：温度35 ℃、初始pH值8.5、最适碳源葡萄糖的添加量2%、最适氮源蛋白胨的添加量3%。此条件下酶活为388.34 U/mL，与原始培养基的产酶量相比，优化试验可显著增加培养基的产酶量。