成肌分化过程中相关因子的研究进展*

张 栋,王 欣,史东林 综述,熊 雷 审校

(1.清华大学体育部，北京 100084；2.河北医科大学第三医院足踝外科，河北 石家庄 050051；3.河北体育学院,河北 石家庄 050041；4.重庆市渝北区人民医院，重庆 401120)

运动性损伤多见于大强度和不习惯的剧烈离心运动后，但并不是运动时或运动后即刻发生的，常表现为迟发性肌肉酸痛，目前认为肌肉微撕裂是造成迟发性肌肉酸痛的原因[1-2]。运动性损伤后肌肉修复相关的研究已经向肌肉组织的超微结构、分子机制和基因水平拓展[3]。肌肉修复的治疗方法主要有营养疗法、运动疗法及药物疗法等，但这些方法的治疗效果有限。目前，研究提示基因靶向治疗可能是肌肉修复的有效治疗方法，通过基因靶向治疗提高骨骼肌的再生与修复能力。

1 肌肉再生与修复机制

当骨骼肌损伤后，静息的肌卫星细胞被激活，重新进入细胞周期，继而大量增殖、分化、成熟并融合形成新的肌纤维[4]。这个过程受到多种因子调节，其中包括成肌增强子、成肌调控子、配对盒转录因子等调节。

2 成肌因子在成肌分化的作用

2.1人类肌细胞增强因子2(MEF2)基因在成肌分化过程中的作用 MEF2调控肌细胞增殖、分化、生存、凋亡等一系列生物学过程[5]。MEF2家族由MEF2A、MEF2B、MEF2C、MEF2D 4种蛋白质组成[6]。MEF2A、MEF2B、MEF2D存在于人体内各个部位，MEF2C存在于肌肉、脑、脾脏等组织[7]。MEF2蛋白质在这些器官中发挥生物学功能依靠其本身的结构域，MEF2蛋白质由3个结构域组成：N端 MADS box、Mef2 domian、C端反式激活域[8]。MADS结构域和Mef2结构域分别与DNA结合后形成MEF2-DNA二聚体，激活成肌因子启动子调控成肌分化过程[9]。以下对4种MEF2亚基对成肌分化转录调控作用介绍。

YUAN 等[10]在C2C12细胞发现，MEF2A与HDAC5蛋白质协同作用于Cpt1b启动子共同调节Cpt1b mRNA水平表达，促进C2C12细胞成肌分化。 SUN 等[11]为研究MEF2B对成肌分化的过程，选取了孵育13的鸭蛋，在鸭胚中提取的腿部成肌细胞，通过异位表达表达Akirin1，导致MRF4和MEF2B表达增加，从而证明MEF2B对成肌分化过程的促进作用。

MEF2B蛋白质结构与其他3种亚型不同，在肌肉组织中涉及相关基因的报道很少[12]。NELSA 等[13]为研究MEF2C基因在哺乳动物成肌过程中的作用，在小鼠胚胎期将MEF2C基因敲除让其发育，发现MEF2C基因敲除小鼠肌肉组织的肌纤维排列紊乱，但对小鼠成肌分化进程影响不大。 SUI 等[14]研究发现在C2C12细胞中，长链非编码RNA Lrm与MEF2D有着密切关系，通过过表达长链非编码RNA Lrm导致MEF2D表达增加，促进成肌分化进程。

对于MEF2D相关研究进展中，YANG 等[15]在研究必需氨基酸对猪生长的影响中发现，喂养必需氨基酸的实验组较对照组中的蛋氨酸、半胱氨酸和牛磺酸浓度偏低，甘氨酸和组氨酸水平均偏高，同时MEF2D表达量增加，且实验猪生长状况较对照组好。OGAWA等[16]研究发现，在成肌刺激因子作用下MEF2D DNA结构域和转录结构域糖基化修饰降低。敲低糖基化的MEF2D，通过招募Myogenin启动子启动成肌调控过程。

虽然MEF2基因调控着成肌分化过程，寻找其直接调控底物是研究其分子机制的关键。MEF2蛋白质底物氨基酸序列相似程度高，为寻找其直接调控底物提供了有效的依据[16]，ESTRELLA等[13]发现4个MEF2的底物蛋白质，成肌分化抗原(MyoD)蛋白质是其中之一。

2.2MyoD基因在成肌分化过程中的作用 WARDLE 等[17]研究发现，MyoD是成肌分化过程中的重要调控因子。MyoD的表达主要受2个增强子区域的调控。这2个增强子区域位于转录起始位点上游24 kb的区域内，调控胚胎、胎儿和成人中MyoD的表达。MyoD的基因序列看似简单，但其调控机制却很复杂，不同的转录因子复合物作用于这2个增强子，调节成肌细胞分化过程。MyoD上游区域的一系列表观遗传修饰也在发育和再生过程中激活和抑制MyoD的表达。

SOLEIMANI等[18]通过染色质免疫沉淀测序对MyoD全基因组分析表明，MyoD基因中原性顺式调节元件(CREs)的E-boxs序列调控成肌分化过程。E-boxs序列是否发生位置突变直接决定CREs与其他复合物的结合能力和遗传特性。

JUNG等[19]发现，MyoD在TRIM72通过靶向胰岛素受体底物-1抑制成肌分化过程中起到了重要协同作用。其机制为MyoD分别与TRIM72启动子的近端E-box和MEF2位点作用，进而定向突变，从而抑制成肌分化。

KHILJI等[20]研究发现，RXR选择性激动剂直接调控MyoD能促进成肌细胞向成熟的肌管分化和融合。LAMARCHE等[21]研究发现，敲除成肌细胞中SMAD2基因不影响成肌细胞分化的效率，但产生的肌管小，分化终末MyoD的表达减少。

2.3Pax3/Pax7基因在成肌分化过程中的作用 MAYRAN等[22]在研究中发现，构成哺乳动物配对结构域(PD)因子家族的9个Pax转录因子，在许多生物学过程中发挥着重要作用。Pax基因序列中包含了PD结构域和DNA识别区，该序列是Pax基因发挥生物学功能的主要位点。Pax3/Pax7基因属于Pax家族成员，他们可以激活大量参与成肌分化调节的基因[23]。Pax3在胚胎早期骨骼肌形成中发挥主要作用，而Pax7在成人出生后生长和肌肉再生中占主导地位[24]。Pax3/Pax7调节成肌分化过程有共性也有特性。YANG等[25]在C2C12细胞中分别过表达Pax3和Pax7后，研究发现Pax7而不是Pax3上调Zac1和GPR39的表达。KANAYAMA等[23]研究发现，在肺泡横纹肌肉瘤中，通过敲除PAX3-FOXO复合物后抑制成肌分化过程。AI TANOURY等[26]研究发现成肌干细胞能参与人肌肉损伤修复过程。在过表达Pax7和MYOG的间充质干细胞中，观察到有成肌干细胞的功能。

2.4MyoG基因在成肌分化过程中的作用 MyoG蛋白质是MyoD蛋白质的直接转录调控靶点[27]，MyoD蛋白质作用于MyoG蛋白质后导致其DNA染色质构象发生改变[28]。

LIU 等[29]发现，CASZ1基因通过调控MYOD和MYOG的表达诱导骨骼肌和横纹肌肉瘤分化。YOHE等[30]研究发现，在横纹肌肉瘤中，致癌基因RAS通过RAF-MEK-ERK信号通路抑制了成肌分化调控因子MyoG表达抑制成肌分化过程。其机制主要机制为MyoG序列上的依赖ERK2的RNA聚合酶Ⅱ的启动子失活。临床研究发现曲美替尼这种药抑制MEK表达导致MyoG启动子处ERK2的丢失，抑制MyoG转录表达过程。

HUANG等[31]研究发现在牛成肌细胞中，过表达DEC1导致MyoG表达降低抑制成肌分化过程。TONG等[32]研究发现，在牛成肌细胞中MiR2245-5p通过靶向作用于RAD9A和MyoG的表达调控增殖和分化过程。

3 富含亮氨酸重复序列和跨膜结构域1(Lrtm1)基因研究现状

3.1Lrtm1蛋白的结构 LRTM1是位于人染色体3p14.3的蛋白编码基因[33-34]。Lrtm1属于细胞外LRR富集超家族[35]。其由一个信号肽，LRR氨基末端，6个LRRs，一个LRR羧基末端，一个跨膜结构域和一个含有小段酸性残基的短的细胞质尾部组成[36]。

Lrtm1蛋白质的LRR结构域是富含亮氨酸的重复序列，是存在于许多具有不同功能的蛋白质中的20～29个残基的序列基序。其主要功能是为形成蛋白质-蛋白质相互作用提供多功能的结构框架。Lrtm1具有这个结构域，表明Lrtm1蛋白质发挥生物学功能可能需要借助其他蛋白质的相互作用。Lrtm1蛋白质还包含一个跨膜结构域，因此认为Lrtm1蛋白质定位在膜上[37]。

3.2Lrtm1蛋白质的生物学功能 NABESHIMA等[38]报道在对先天性膈肌发育缺陷的研究中发现，Lrtm1在膈肌发育障碍的基因敲除小鼠中的表达显著下降，提示Lrtm1可能参与了膈肌形成的调控。LI等[39]报道Lrtm1抑制FGFR1信号通路中ERK基因表达，从而促进成肌细胞分化。

骨骼肌之所以具有很强的再生能力，是因为其含有少量的骨骼肌干细胞，即肌卫星细胞[40]。生理状态下肌卫星细胞处于静止状态，其膜电位较K+生理平衡电位低，该情况下能激活选择性阳离子通道如瞬时受体po-(TRPC)[41]，该受体通道定位于骨骼肌纤维浆膜和基底膜之间[33]。激活的瞬时受体po-(TRPC)让大量K+离子内流，进一步诱发一系列生物学过程。而成肌细胞(卫星细胞)向骨骼肌的定向分化过程受一系列成肌转录因子的层级调控，包括Pax7、Myod、Myf5、Mrf4及Myogenin等[33]。

3.3推测Lrtm1基因可能参与的其他信号通路 Lrtm1是跨膜蛋白质[36]，LI等[39]报道Lrtm1通过FGFR1信号通路促进成肌细胞分化，是否存在其他信号通路。调研类似的跨膜蛋白参与调控骨骼肌形成的文献。TONG等[32]研究发现，在牛成肌细胞中MiR2245-5p通过靶向作用于RAD9A和MyoG的表达调控增殖和分化过程。他们在牛成肌细胞增殖分化不同阶段采用stem-loop RT-PCR技术检测MiR2425-5p的表达水平。细胞增殖实验研究中发现显示，MiR2245-5p促进RAD9A表达从而促进细胞增殖过程。免疫荧光技术中发现MiR2245-5p抑制MyoG表达，进而抑制成肌分化过程。

BELLOMO等[42]研究发现，血管紧张素Ⅰ型受体是一种经典的G-蛋白偶联受体，信号通过G-蛋白底物激活了MAPKs通路。为证明血管紧张素Ⅱ型受体影响成肌分化过程。首先用血管紧张素Ⅱ型受体激活剂和受体抑制剂来观察对肌肉再生的影响。通过SiRNA敲低血管紧张素Ⅱ型受体表达来观察对肌肉再生的影响。HARON[43]发现，血管紧张素II型受体是通过ERK1/2信号通路来调控成肌细胞的分化过程。

YOSHIDA等[44]研究降钙素通过激活了PI3K/Akt，P38 MAPK信号通路促进成肌细胞的增殖，通过激活GPRC6A-ERK1/2促进成肌细胞的分化。对于Lrtm1基因的对骨骼肌损伤与修复的机制研究，首先从几个常规的信号通路去考虑如增殖的P38/MAPK信号通路及ERK1/2信号通路等。GPRC6A是通过左旋氨基酸激活的G蛋白偶联受体[45]。其与降钙素结合形成复合物后启动成肌的转录调控[44]。

4 结语与展望

运动性肌肉损伤严重影响普通人群的生活和工作及专业运动人群的训练和比赛[46-47]。如何让损伤的肌肉修复，从骨骼肌再生修复的分子机制探索，在分子层面来研究Lrtm1基因对骨骼肌再生修复的影响，从而寻找一种基因替代治疗的方法。

本文通过引用相关文献分析了解Lrtm1基因相关信息，在定位Lrtm1蛋白质位置时，可以通过免疫荧光这个实验技术方法来观察Lrtm1蛋白质的定位。在确定Lrtm1蛋白质分子量时可以通过Lrtm1蛋白质的信号肽来分析。本文综述成肌转录因子和成肌增强子对成肌分化的作用，为后续证明Lrtm1基因对骨骼肌再生修复影响打下基础。最后根据Lrtm1蛋白质结构分析，推测Lrtm1基因可能参与的信号通路。发展基于Lrtm1基因及其相关分子为靶标的骨骼肌损伤的基因治疗提供了理论基础。