宏基因二代测序在儿童肺炎病原体检测中的应用

邢芮宁 综述，李渠北 审校

(重庆医科大学附属儿童医院，重庆 400014)

肺炎造成儿童死亡的人数超过任何其他传染病。根据2020年联合国儿童基金会数据显示，肺炎是5岁以下儿童首要死因，平均每39秒就有1例儿童死于肺炎[1]。其病原体快速且准确地鉴定是儿童肺炎早期明确诊断和合理用药的基础。目前，临床上被广泛使用的病原学检测方法仍然是基于19世纪80年代由巴斯德开创的基于培养的技术[2]，在检测速度及灵敏度等方面具有较大局限性。近年来，随着宏基因二代测序(mNGS)技术的出现，为明确肺炎病原体提供了一种新的检测方法。该技术具有通量高、敏感性高的优势，可以同时检测几百万到上亿条核酸序列，提高了全基因组的测序速度，并降低了单个碱基测序的成本[3-5]。

1 儿童肺炎病原学检测现状

肺炎作为临床上常见的儿童呼吸道感染性疾病,病原体包括细菌、真菌、病毒、肺炎支原体、衣原体等，种类繁多、构成复杂。肺炎发病率高，致死率可达30%～50%，对儿童生命及健康构成严重威胁[6]，早期识别病原体对指导肺炎的诊疗及改善预后具有很大帮助。

传统病原学检测方法包括病原分离培养、血清学抗体检测、抗原检测、聚合酶链反应(PCR)技术等。病原分离培养法作为目前临床诊断的“金标准”，在临床上最为常用。该检测技术可以检测多种病原体，并且根据药敏试验结果对临床治疗给予相应指导，但培养周期长，且操作过程复杂。此外，长期的抗生素使用会降低培养敏感性，即使检测结果为阴性，也不能完全排除感染[7]。血清学抗体检测法通过免疫学方法明确感染后患儿免疫状态，无须经过培养，对于传统培养基下不易生长的病原体具有一定检测优势，但对于免疫系统发育不全及免疫力低下的患儿，容易产生假阴性结果[8]。抗原检测方法主要针对血清型较少、细胞培养不能增殖的呼吸道病原体，其检测标本范围广，无论是痰液、支气管肺泡灌洗液(BALF)，还是胸腔腹水均可作为标本，其特异性高、操作简便、反应时间短，对于病程中使用过抗生素治疗的患儿仍可以检测出病原体[9]，已逐渐成为儿童肺炎病原体检测的主流方法[10-11]，但与其他检测方法相比，其敏感性较低。PCR技术是一种体外介导DNA序列酶促反应合成的分子生物学技术，具有操作简单、特异性及敏感性高等特点，且检测结果几乎不受抗生素影响，对混合感染的病原学诊断尤其适用，近年来临床应用价值逐渐提升。但PCR技术对操作规范和质量控制要求严格，且容易产生假阳性结果，与病源分离培养相比，不能反映药敏试验结果及耐药性[12]。目前，临床上各种病原体检测方法应用广泛，但仍有15%～25%的肺炎患者无法明确病原学诊断。由此可见，传统病原体检测方法已很难满足目前儿童肺炎诊治的需求。

2 宏基因二代测序(mNGS)在儿童肺炎病原体检测方面的应用进展

2.1mNGS概述 NGS是在一代Sanger测序技术基础上发展起来的一项新型测序技术。1998年RIZZO等[13]首先提出这一概念，2004年美国国立人类基因组研究所正式发起该项目的研究；2005年焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统首次被报道[14]；2014 年第1篇使用 NGS 检测脑脊液标本并明确钩端螺旋体感染病例的国外杂志报道[15]，至此，NGS开始广泛应用于临床研究。

NGS技术包括对样本中所有的遗传物质进行测序的mNGS和利用基因组中特定的标记基因(例如16S rRNA)仅对样本中的微生物进行种系发育分析的宏分类组学。mNGS可以直接从样本中提取其中所有的核酸序列，并进行大规模测序，无须经过培养[16]。因此可以边合成边测序，临床操作步骤包括：临床标本的采集与运输；标本核酸提取、DNA 和(或)RNA 富集；DNA文库制备；高通量测序和生物信息学分析等步骤。

2.2mNGS的优势 同一代Sanger测序技术相比，mNGS通量更高，即每次测序反应所能读取的DNA序列的数量更多；mNGS的平均读取长度更短，使检测每个碱基的成本更低，以常见平台为例(BGI、Illumina、Roche、SoLiD)，mNGS平均读取长度为30～400 bp，而Sanger测序法可读取的长度范围是500～1 000 bp[17]，这在一定程度上限制了mNGS可以进行的实验类型，但在过去5年里使检测碱基成本较一代测序降低了近10万倍以上[18]，并由此产生巨大的序列数据集[19]。

此外，mNGS对标本选择不具有偏向性，可检测的标本包括血液，痰液，肺泡灌洗液，脑脊液，胸、腹水等；所有已知基因组序列的病原体均可被mNGS报告，目前已被纳入的病原体包括4 000余种病毒、3 000余种细菌、200 余种真菌和140余种寄生虫[20]。越来越多的临床证据表明mNGS正在临床被广泛应用。无论是皮肤感染，还是眼部、泌尿系统、骨关节的感染，mNGS病原体检出率均高于传统病原学检测[16,21-22]；mNGS对肿瘤标记物可以作出更加准确的临床诊断，明确致病基因，为临床治疗方案提供有利支持[23-24]。在产前诊断方面，mNGS利用其敏感性高的特点，可以对微量DNA物质进行检测，对胎儿进行产前无创性染色体疾病筛查[25-26]。此外，与病原培养等方法相比，既往使用抗生素对mNGS结果影响小[27]。mNGS还可以识别罕见病原体及发现新的病原体，对弓形虫、隐球菌、风疹病毒、阿米巴原虫等临床检出率低的病原体具有更高的提示性[28-30]，在多重复杂耐药突变的检出上也可以提供一定数据支持[31-32]。

2.3mNGS在儿童肺炎病原体检测方面的临床应用 李学青等[33]回顾性分析了mNGS对重症肺炎儿童的肺泡灌洗液标本的病原学诊断，结果显示：34例患儿中有32例检出病原体(检出率为94.1%)，经抗感染等对症治疗后，33例患儿好转出院，1例患儿死亡。表明mNGS 在重症肺炎上可以提高病原检出率，并对临床治疗起到指导作用。FARNAES等[34]对15例诊断为社区获得性肺炎儿童进行了游离血浆的mNGS，结果显示，mNGS发现了13例(86%)的病原体，而在仅使用标准培养和PCR方法的儿童中，为47%。表明mNGS与传统方法比较敏感性更高。而且，在这 15 例儿童中，7 例在mNGS结果回示后调整了抗生素治疗方案。说明 mNGS 亦可以提高儿童下呼吸道感染病原菌的检出率，有利于精准诊疗的实施。ZINTER 等[35]对 34 例免疫缺陷儿童共41份下呼吸道标本进行mNGS，结果显示：在传统方法检测到病原体的17例样本中，有14例结果和mNGS结果一致，另外3例mNGS检出了传统方法未曾检测到的病原体。在24例传统方法未检测到病原体的样本中，有11例mNGS检测出了可能导致感染的病原体，剩下的13例则未能检测出。表明mNGS 可提高对呼吸道病原体检测敏感性，ATKINSON等[36]研究也有相似发现。此外，YUN等[37]研究发现，mNGS早期病原体检出率高，有助于指导个体化治疗，降低经验用药所致的耐药性，降低患儿病死率。

2.4儿童肺炎的mNGS标本选择 儿童肺炎的mNGS检测标本通常包括外周血、痰液、BALF、咽拭子等[38]，应尽量在疾病早期采样本并尽快送检。专家共识指出，在检出细菌及真菌方面，BALF标本具有更高的敏感性；而在检测病毒方面，外周血标本检出率更高。其中腺病毒BALF和血mNGS同时可以检出[39]。对于EBV、CMV等不引起肺炎的病原，即使外周血检测到也不考虑为导致肺炎的病原体。对于单纯肺炎患者，经支气管镜操作采集的BALF标本要优于痰和外周血标本；而对于重症肺炎患者，可采取多种类型样本(血液、痰液或BALF)、多种方法学病原体培养、细菌/真菌涂片、PCR检测或mNGS平行送检，以便相互印证结果，其中优先选送BALF标本[40]。

2.5mNGS灵敏度及影响因素 mNGS的灵敏度与测序数据量(检测总序列数)及致病微生物基因组的碱基数呈正相关，与单位体积标本中人源细胞含量及背景微生物基因数呈负相关。在测序数据量确定的情况下，常见影响mNGS检测灵敏度因素包括病原体基因组大小、细胞外游离DNA(cfDNA)数目、细胞壁厚度、人源细胞占比、背景微生物占比等。其中病原体基因组越大，mNGS灵敏度越高，通常寄生虫病原体最大，真菌次之，细菌和病毒的基因组较小；由于mNGS检测的是cfDNA，对于一些胞内寄生病原体(如伤寒沙门菌等)检出率较低[41]；结核分枝杆菌(MTB)等细胞壁较厚的细菌，核酸提取率低，导致检出灵敏度降低，在众多病原体中，病毒核酸提取率最高，细菌次之，真菌及MTB核酸提取率相对较低；人源细胞占比及背景微生物占比也是影响灵敏度2个重要因素。就肺炎检测标本而言，BALF的人源细胞占比少于外周血，痰液的人源细胞占比更高；背景微生物主要包括定植微生物和污染，其不仅影响mNGS检测结果，还对传统病原学检测结果会产生干扰[31,42-44]。

3 mNGS目前存在的问题

3.1结果判读标准 mNGS虽然可识别临床样品中的全部病原体，但由于不同种类的微生物基因组长度不同，不同平台之间无统一质控标准，目前对于mNGS报告尚无统一的结果判读标准，而是由临床医生结合症状综合判定[31,43-44]。

3.1.1阳性阈值的界定 多篇专家共识指出，对于检出的可能致病微生物不能只关注序列数的多少，需结合该序列在基因组的覆盖度和特异性进行评判[43,45]。一般序列数和致病可能性成正比，以及检出序列数越高，致病可能性越大，而对于极少存活于环境中的病毒，即使检出少量的特异序列(<3条)就可判为阳性[43]。对于MTB、布鲁氏杆菌等检测难度较大的病原体，检出1条特异序列即可判为阳性[27,44]。

3.1.2致病菌、定植菌和污染菌的区分 定植微生物广泛存在于人体及检测环境中，这是拥有高敏感性的mNGS检测过程中无法避免的，往往会将真正导致疾病的病原体掩盖，因此，当考虑条件致病菌时，应首先分析临床患儿的基础疾病、免疫状态及标本的来源。对于检出大量的杂菌序列而没有主导的微生物时，则首先考虑污染菌，其次考虑为条件致病菌[46]。

3.1.3假阴性结果与假阳性结果分析 对于临床症状符合，且其他传统检测方法高度提示的病原体，即使mNGS结果为阴性，也不能排除感染可能，可根据临床需要必要时再次行mNGS检测；而对于mNGS检测为阳性，而临床症状不支持的检测结果，需结合其他传统检测方法进行评估，并以传统实验室检测结果为首选参考依据[46]。

3.2对RNA病原体检出率低 DNA病毒的基因组可以通过直接从样本中提取进行mNGS检测，而RNA病毒由于其遗传物质丰度低，易降解，需先逆转录为与其互补的DNA再进行测序[47]。此外，人源RNA同DNA相比的丰度和复杂度更高，更易降解，对样本运输和保存要求也更高。以上因素导致mNGS对RNA病毒的检测率较低。在检测前对RNA病毒进行富集对提高检出率有所改善。

3.3检测周期长 目前，病原微生物mNGS检测的周期一般是72 h内。与病原培养、血清学检测和一般细菌/真菌涂片等技术相比，mNGS技术可一次检测包括细菌、真菌、病毒和寄生虫等多种类型的病原体，并且不受分离培养的限制，在核酸序列水平对病原体进行准确分析。但是，与临床需求相比，尤其是对于急症患者来说，mNGS在检测周期时长上仍需进一步改进。

3.4与其他常用实验室检查相比费用较高 虽然mNGS的检测成本同Sanger技术相比大大降低，但与其他传统实验室检测相比仍花费巨大。目前，临床传统实验室检测的费用在数十元至百元不等，而一次mNGS检测需花费上千元。高昂的检测成本也是限制mNGS在临床广泛应用的因素之一[39]。

4 结语与展望

近年来，mNGS作为一种新兴的临床病原体检测方法，可以检出临床标本中所有的病原体，通量高、敏感性高，在罕见、不典型病原体及混合感染的病原体检出上体现了自己独特的临床价值，以上优势已被多篇指南及专家共识认可并推荐临床使用[48-51]。在儿童肺炎的病原体检测中，mNGS提高了病原体检出率，对早期针对治疗起到指导作用，对缩短肺炎病程，减少并发症具有重大意义。然而，作为一项新技术，mNGS仍存在一些不足之处，如检测过程尚无统一质控标准；标本处理复杂，一旦发生污染对检测结果影响较大；检测成本相对较高；检测周期长，对于急危重症患儿临床意义较小；对于mNGS检测结果，需结合临床症状及其他传统实验室检测结果共同分析等。因此，mNGS目前尚不能作为临床常规检测方法。但随着相关研究不断进展，mNGS的不足之处将不断改善，检测特异度及灵敏度更高，检测成本更低，在不久的将来有可能取代部分传统实验室检测方法，成为临床上儿童肺炎诊断的一项常规检测。