中医药调控肺癌失巢凋亡研究进展

何灿封，吴健彬，杨红星，林丽珠

1.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405；2.深圳市中医院，广东 深圳 518000；3.广州中医药大学，广东 广州 510405

肺癌是目前全球发病率和死亡率均位居首位的肿瘤。虽然手术、化疗、放疗、靶向治疗及近年来兴起的免疫治疗是目前肺癌综合治疗的主要手段，但大部分患者确诊时已属中晚期，失去手术机会或存在术后高复发风险，多数患者存在无法耐受多程化疗所带来的毒性与产生耐药性等问题，另外仅有少数患者可从昂贵的靶向治疗和免疫治疗中真正获益。相较之下，中医药在临床上广泛用于晚期肺癌治疗，其多靶点、多途径的作用特点以及适用人群广、安全性高和经济成本低等特点越来越受到关注[1]。目前中医药在肺癌带瘤生存和防治复发、转移的优势日益凸显[2]。

转移是肺癌乃至大多数肿瘤疾病的最终致死原因，研究发现失巢凋亡在肺癌转移中扮演了重要角色[3]。失巢凋亡是指由于机体正常细胞与细胞外基质(extracellular matrix，ECM）或其他细胞失去接触而诱导的一种特殊的程序化细胞死亡形式，肿瘤细胞一旦对失巢凋亡产生抵抗性，则极易离开原位通过血液或淋巴液等途径进行远处转移[4]。因此深入研究肺癌的失巢凋亡机制对防治肺癌的转移和复发具有重要意义。

中医药作为祖国医学的重要组成部分，中医药干预肺癌的相关调控机制仍有待阐明。结合目前发现多种中药复方和单体能够诱导肿瘤细胞的失巢凋亡[5]，本文将就其相关机制的研究进展进行综述。

1 失巢凋亡与中医的关系

《素问·生气通天论篇》云：“生之本，本于阴阳”。人体是一个有机的整体，人体内部充满着阴阳对立统一的关系。《素问·阴阳离合篇》云：“阴阳者数之可十，推之可百，数之可千，推之可万，万之大不可胜数，然其要一也。”随着现代医学研究的不断深入，阴阳属性被发现在机体组织、细胞或分子层面上具有普遍性[6]。阴阳是宇宙中相互关联的事物或现象对立双方属性的概括。中医典籍中虽无“凋亡”或“失巢凋亡”一说，但从本质上看，凋亡作为一种生理性程序性死亡，贯穿于细胞生长、分化直至死亡的整个生命活动过程，细胞凋亡与细胞增殖同是维持生物体内细胞动态平衡的基本行为，二者对立相关的属性可从阴阳理论的角度进行认识[7]。阴阳学说认为外向的、兴奋的、上升的属于阳；内守的、抑制的、下降的属于阴。阴阳彼此之间存在对立制约、互根互用、消长、转化、自和与平衡等关系，据此类推，细胞增殖归属于阳，而失巢凋亡属于细胞凋亡的一种类型，归属于阴[8]。《素问·阴阳应象大论篇》：“阴胜则阳病，阳胜则阴病”。一旦机体生理性凋亡出现异常，增殖与凋亡的动态平衡被打破，阴阳失衡，并超过机体的调节能力，将导致细胞的恶性转化和肿瘤的发生。因此有学者[7，9]认为肿瘤的重要病理学基础是细胞的过度增殖而凋亡减退，即细胞水平上的阳盛阴衰。

2 失巢凋亡机制

失巢凋亡是正常细胞(如上皮细胞和内皮细胞）从ECM脱离后引起的程序性死亡，该凋亡过程的执行主要通过外源性途径和内源性途径等[10]。

外源性途径由肿瘤坏死因子α(TNF-α）、凋亡信号配体(FasL）和TNF相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）激活相应的受体蛋白，进一步通过TNF受体相关死亡域(TNF receptor-associated death domain，TRADD）和Fas相关死亡域(Fas-aasociated death domain，FADD），募集caspase-8形成死亡诱导信号复合物(death inducing signaling complex，DISC），caspase-8酶自我剪切激活自身蛋白酶活性，可激活下游效应分子caspase-3，引起caspase级联反应[11]，剪切胞浆和核底物，如ADP多聚核糖核苷酸、核纤层蛋白(lamins）、Caspase激活的脱氧核糖核酸酶(Caspase-activated deoxyribonuclease，CAD）等，降解染色质和DNA，从而引发细胞凋亡[12]。此外，活化的Caspase-8能够切割Bcl-2家族促凋亡蛋白Bid，截短的Bid可以转移到线粒体，与线粒体膜结合促进线粒体膜破坏并释放细胞色素C，细胞色素C与caspase-9酶原、凋亡蛋白酶激活因子(Apoptosis protease activating factor，Apaf-1）形成细胞色素C-Apaf-1-caspase-9“凋亡体”，凋亡体可激活caspase-9，进一步可激活下游凋亡“执行者caspase-3、caspase-7，从而引发caspase级联反应，导致细胞凋亡[13]。

Bcl-2蛋白家族参与了内源性途径，该家族蛋白依据结构和功能可分为：①抗凋亡蛋白，如Bcl-2、Bcl-xL；②含BH1、BH2、BH3结构域的促凋亡蛋白，包括Bax、Bak等；③BH3-only蛋白，包括Bad、Bid、Bim等，其中Bid、Bim属于凋亡直接激活蛋白，可直接结合并促使Bax/Bak寡聚化[14]。正常情况下，抑凋亡蛋白通过结合并抑制促凋亡蛋白来保持线粒体外膜的完整性，促进细胞存活正常细胞中Bim与动力蛋白复合体结合，当细胞失去ECM接触时，Bim会被释放，并移动到线粒体，与Bcl-2/Bcl-xL结合并抑制其抗凋亡功能，并促使线粒体外膜上Bax和Bak寡聚化，寡聚化的Bax/Bak在线粒体外膜形成孔状结构，线粒体膜间隙的细胞色素C可通过线粒体外膜渗透作用从这些通道扩散释放，并形成细胞色素C-Apaf-1-caspase-9“凋亡体”激活caspase级联反应，促使细胞凋亡[15]。

3 失巢凋亡的相关通路

3.1 PI3K-Akt通路

PI3K-Akt信号通路是细胞内重要的信号转导途径，参与细胞代谢、增殖、分化、存活、生长等细胞生物学过程。PI3K是一类脂质激酶，通过磷酸化PI的肌醇环磷酸化位点生成3，4二磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol-3，4-biphosphate，PI-3，4P2）及 3，4，5三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 3，4，5-trisphosphate，PI-3，4，5P3），后者可作为第二信使与Akt结合，促进Akt的Ser473和Thr308位点磷酸化激活。激活后的Akt可促进抗凋亡蛋白Bcl-2的解离、抑制caspase-9活性、下调抑癌基因p53表达、激活核转录因子NF-κB并促使其移位至细胞核、抑制Forkhead家族转录因子活性等[16]多种途径发挥抑制凋亡的作用。细胞在黏附ECM时可触发PI3K/Akt通路，激活的PI3K/Akt上调抗凋亡蛋白(如：Bcl-2、Bcl-XL、NF-κB等）表达和下调促凋亡蛋白(如：Bad、Bim等）表达，进而抑制失巢凋亡的发生[17]。研究表明，黏着斑激酶FAK通过激活PI3K-AKT途径在肺癌细胞发挥抗失巢凋亡作用[18]。塞来昔布在人肺癌A549细胞系在体内外实验中可促进失巢凋亡，降低肺癌转移，其机制主要与抑制PI3K/Akt等途径促进Bim的表达，并抑制Mcl-1的表达有关[19]。

3.2 整合素通路

整联蛋白(integrin）又称整合素，存在于细胞表面，是调节细胞间和细胞-细胞外基质粘附的跨膜受体蛋白，介导着细胞与ECM的附着以及从ECM到细胞的信号转导，调控细胞迁移、粘附、增殖、凋亡等。一方面，整合素通过形成黏着复合物能特异性识别ECM中的不同配体(如纤连蛋白、玻连蛋白和层粘连蛋白等）精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列，将细胞骨架与之耦合。另一方面，整联蛋白被ECM的配体激活后构型发生改变，活化下游激酶，如粘附斑激酶(focal adhesion kinase，FAK），整合素连接激酶(integrin-linked kinase，ILK），Src，PI3K，ERK等，其中FAK是整合素信号途径中的关键激酶，FAK激活后可通过Src激酶激活下游PI3K-AKT、RAS-MAPK等通路维持细胞生存[20-21]。研究表明[22-23]，整联蛋白介导的FAK激活是抑制失巢凋亡的关键。当正常细胞(如上皮细胞和内皮细胞）与ECM脱离接触后，整联蛋白信号转导水平下降，FAK依赖的PI3K存活通路磷酸化水平下降，使关键的下游生存效应因子(PI3K、Akt、ERK）失活，并激活caspase级联反应，诱发失巢凋亡。

3.3 MAPK通路

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK）途径的级联激活是细胞内信号传递网络的关键途径之一。经典的MAPK信号转导以三级激酶级联激活方式(MAPKKK→MAPKK→MAPK）将细胞外信号刺激(如氧化应激、紫外线照射和生长因子等）传递到细胞核。MAPK信号通路主要包括ERK1/2、p38 MAPK、JNK/SAPK和BMK1/ERK5等4个MAPK亚族蛋白及其所属通路[24]，其中p38 MAPK和JNK/SAPK通路除了影响细胞增殖、分化、应激反应，同时还参与调控细胞凋亡。细胞脱离ECM后，FAK到MAPK信号转导通路受到抑制，激活caspase级联反应而发生失巢凋亡[25]。目前发现p38 MAPK通过磷酸化p53、上调Fas/Fas L途径、激活c-Fos/c-Jun、促进Bax易位、激活caspase等多种途径调控细胞凋亡[26]。JNK促凋亡机制主要为JNK既可通过激活c-Jun/AP-1依赖性途径，上调p53、FasL以及Bcl-2家族的促凋亡蛋白，还能促进细胞色素C释放进入胞浆，激活caspase级联反应而触发失巢凋亡[27]。研究表明[28]，MAPK通路上调与失巢凋亡抵抗有关，并与PI3K-Akt途径有串扰和相互补偿作用。

3.4 经典Wnt/β-catenin信号通路

Wnt属于分泌型糖蛋白，在细胞受到外界信号刺激后分泌到细胞外，与细胞膜上的Wnt受体结合引起Wnt通路激活，其中β-catenin是Wnt信号通路的核心蛋白，胞浆中的β-catenin主要与细胞表面的E-cadherin形成复合体，以维持胞间连接和粘附，阻碍细胞侵袭及转移。无Wnt信号时，细胞支架蛋白Axin结合糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK3β）、 腺 瘤 性 息 肉 病(adenomatous polyposis coli，APC）蛋白以及酪蛋白激酶1(CK1）组成的APC复合体，调控了β-catenin的降解，具体为Axin结合了β-catenin后，CK1和GSK3β可磷酸化β-catenin，使其通过泛素-蛋白酶体途径降解。而当Wnt信号分泌后，可与细胞膜上的跨膜受体卷曲蛋白frizzled受体以及协同受体脂蛋白受体相关蛋白5/6(LRP5/6）结合形成复合物，募集胞质内的蓬乱蛋白(Dishevelled，Dvl），促进CK1和GSK3β介导的LRP5/6磷酸化，磷酸化的LRP5/6募集Axin至细胞膜上，导致APC复合物失去Axin蛋白的支架作用而发生解体，从而抑制了CK1和GSK3β磷酸化β-catenin，β-catenin不降解而积累后可从胞浆易位到细胞核，取代转录协同因子T细胞因子(T cell factor，TCF）/淋巴增强因子(Lymphoid Enhance Factor，LEF）上结合的共阻遏物Groucho，并结合CBP/p300、BCL9和Pygo等辅转录因子形成转录复合体，从而启动下游的靶基因转录表达[29-30]。研究发现，Wnt信号和TGF-β以协同方式参与诱导上皮间质转化，驱动失巢凋亡抗性[31]。此外，Wnt/β-catenin不仅抑制肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF）/c-Myc介导的细胞凋亡，而且抑制依赖于死亡受体信号通路的失巢凋亡[32]。

3.5 TGF-β/Smad通路

TGF-β/Smad通路在细胞和组织的生长、分化、凋亡、免疫反应以及ECM的合成等具有关键作用。TGF-β信号在与细胞膜上的丝氨酸/苏氨酸激酶受体，即Ⅱ型受体(R Ⅱ）和Ⅰ型受体(R Ⅰ）形成受体复合物后，首先磷酸化激活R Ⅱ，继而由R Ⅱ磷酸化激活RI，激活的RⅠ招募并磷酸化下游的调节型Smad(R-Smad，即Smad2/3），磷酸化RSmad与通用型Smad(Co-Smad，即Smad4）形成Smad2/3/4异源寡聚体并转运入细胞核。Smad信号转导复合物与目的基因启动子区的Smad反应元件结合，并同转录因子FAST1、辅转录因子CBP/p300等协同作用，对靶基因的表达进行正向或负向调控[33]。另一方面，抑制型Smad(I-Smad，Smad6/7）可通过抑制R-Smad与R Ⅰ的相互作用，阻碍R-Smad/Co-Smad复合物形成、抑制转录等对TGF-β/Smad信号通路进行负反馈调节[34]。研究表明，TGF-β/Smad4信号通路的激活在恢复失巢凋亡敏感性有重要作用[35]。整合素通路上调后，可增加FAK2蛋白表达水平，通过失活NF-κB以及激活caspases级联反应提高细胞对失巢凋亡的敏感性[36]。

3.6 NF-κB信号通路

NF-κB是一种以二聚体的形式存在的细胞核转录因子，NF-κB信号通路参与免疫、炎症、应激反应、细胞凋亡等多种生物进程。静止状态时，NF-κB与抑制因子IκB结合组成无活性的三聚体。在经典 NF-κB 信号通路中，IκB 激酶(IκB kinase，IKK）在细胞接受对应信号刺激后被激活，进而磷酸化IκB蛋白，并促使其泛素化和溶酶体降解，NF-κB得以释放，并在经过磷酸化激活后转位到核内启动相应靶基因转录和表达[37]，其靶基因包括了c-FLIP、bcl-xl等抑制失巢凋亡蛋白[38]。研究表明[39]，DBC1通过激活NF-κB促进失巢凋亡抗性。miR-200c靶向NF-κB上调的TrkB/NTF3自分泌信号环增强失巢凋亡的敏感性[40]。

4 中医药调控肺癌失巢凋亡的相关研究

近年来研究发现中医药复方或单体可能通过影响肺癌细胞失巢凋亡途径而发挥疗效，其机制包括了上调Bax、caspase-3、caspase-9凋亡蛋白表达，下调Bcl-2蛋白抗凋亡蛋白表达，抑制低ERK和Akt等存活信号蛋白表达以及干预TGF-β/Smad通路、整合素通路等方面。现将其介绍如下：

4.1 中药复方

复方中药金复康[41]可以预防肺癌的复发和转移，循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs）可能是其干预肺癌转移的重要靶点。研究发现金复康能抑制肺癌CTC-TJH-01细胞系和肺癌H1975细胞系的增殖、迁移和侵袭，还能诱导CTC-TJH-01和H1975细胞失巢凋亡。mRNA表达谱分析显示，金复康对ECM-受体相互作用和焦点黏附均有调节作用；对整合素/Src通路具有明显的抑制作用，提示金复康抑制CTCs的迁移和侵袭机制可能与抑制整合素/Src轴诱导失巢凋亡有关，从而发挥抗肺癌转移作用。

益气除痰方[42]具有肺癌细胞增殖，诱导其失巢凋亡的作用，并且具有剂量依赖性，同时发现了该方可降低P-akt蛋白表达，但对P-p38蛋白(MAPK通路蛋白）的表达无显著影响，由此推测其诱导失巢凋亡作用或与PI3K/akt信号通路相关。

清金得生片[43]有诱导肺癌细胞失巢调亡的作用，并且呈现剂量依赖性，进一步还发现了p-Akt表达与凋亡率、含药血清呈负相关，结合文献及既往研究推测清金得生片发挥失巢凋亡作用或与抑制P-akt的活化，降低下游端粒酶活性，下调bcl-2基因的表达有关。

4.2 中药单体

一项研究[44]发现，白芷根活性成分欧前胡素可增强H23以及H292、A549等人肺癌细胞对失巢凋亡的敏感性，进一步研究表明了欧前胡素提高了p53蛋白水平，下调了Mcl-1蛋白并上调Bax，但对Bcl-2的表达影响很小。姜黄素[45]被发现在失巢凋亡期间下调Bcl-2蛋白，并使肺癌细胞对脱离诱导的细胞凋亡敏感，同时该过程可被超氧阴离子清除剂Mn(Ⅲ）tetrakis(4-benzoic acid）porphyrin(Mn(Ⅲ）TBAP）所抑制，并推测姜黄素通过泛素-蛋白体降解降低Bcl-2水平，使肺癌细胞对失巢凋亡细胞凋亡敏感。老鹳草素[46]可通过抑制TGF-β1介导的EMT以及肺癌A549细胞迁移、侵袭和失巢凋亡抗性等。千层纸素[47]可通过阻断c-Src/AKT/HK II通路介导的葡萄糖剥夺样机制使A549肺癌细胞对失巢凋亡敏感。

多种石斛提取物如石斛酚[48]、构唇石斛素[49]以及 Ephemeranthol A[50]和 dendrofalconerol A[51]等被 发现可抑制H460人肺癌细胞的上皮间充质转化，并使其对失巢凋亡敏感，相关机制涉及了降低ERK和Akt等存活信号蛋白的活化，下调Cav-1蛋白表达并引起Mcl-1抗凋亡蛋白减少，以及减少抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达，激活caspase-3和caspase-9凋亡蛋白表达等。

人参皂苷 Rk1、Rg5[52]或 20(R）-Rg3[53]等可抑制TGF-β1诱导的EMT以及肺癌A549细胞迁移、侵袭和失巢凋亡抵抗的抗性，其机制或与抑制TGF-β1下游的Smad和NF-κB/ERK信号通路有关。

5 结语

中医药目前广泛用于肺癌的临床治疗，并在带瘤生存、防治复发及转移等方面日益凸显优势。现有研究发现，中药复方或单体可通过多靶点、多通路诱导肺癌细胞恢复失巢凋亡敏感性。因此，采用中医药干预促进肺癌细胞失巢凋亡来抑制肿瘤转移将是一种新的研究思路。然而，目前有关肺癌失巢凋亡中医药也面临着一些等问题，诸如未有效结合动物模型进行体内验证，未结合功能回复或分子互作等手段进一步验证相关结论等，因此未来研究应着重采用更为深入细致的方法来研究相关干预机制，同时探索和挖掘更多相关潜在的靶点和信号通路，以进一步丰富和拓展中医药干预肺癌细胞失巢凋亡的内涵。