蛋白质组学技术在恶性肿瘤中医辨证及诊治中的研究进展

邓海滨，王中奇，蔡玥娇，胡紫洁，张铭，龚亚斌，鲁叶云，徐振晔

1.上海中医药大学附属龙华医院肿瘤科，上海 200032；2.上海交通大学附属胸科医院中西医结合科，上海 200030；3.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院肿瘤科，上海 200437；4.上海市第十人民医院崇明分院中医内科，上海 202159

1994年，澳大利亚学者Wilkins和Williams最先提出蛋白质组(proteome）的概念，即一个有机体的全部蛋白质组成及其活动方式[1]；1995年，proteome一词首次出现在Electrophoresis杂志上[2]；1997年，两人合作出版第一部关于蛋白质组学的专著[3]。2001年，“人类基因组计划”的顺利完成使恶性肿瘤的研究进入“后基因组时代”[4]。由于基因的功能主要通过蛋白质来实现，因此，蛋白质组学是基因组学研究逻辑性发展[5]。同年，Abbott[6]与Fields[7]分别在Nature和Science上发表评述，将蛋白质组学的地位提高到人类基因争夺战的战略制高点之一。随着众多国际交流平台的相继搭建，都极大推动了蛋白质组学的发展。近年来，蛋白质组学研究在肿瘤诊疗相关领域也发展迅速[8-9]。

1 蛋白质组与蛋白质组学的概念

蛋白质组(proteme）一词将蛋白质(protein）与基因组(genome）两个词的概念进行了集合，它指的是由细胞或组织的基因所表达的所有相应的蛋白质[10]。蛋白质组学则是基于蛋白质分离技术、质谱鉴定技术和生物信息技术，研究基因所表达的全部蛋白质功能、结构及其相互作用的学说。

蛋白质组学可以对变异基因翻译后的蛋白质产物进行全面的了解，对其进行功能分析，发现蛋白质相互作用网络[11]。它在生命科学研究中的重要价值在于，它可以在特定的时间、特定的生理或病理状态下，观察一个完整的蛋白质组或蛋白质亚型的一系列变化，故而对研究疾病的病因、诊断及治疗的机制具有非常重要的作用[12]。

2 应用蛋白质组学技术研究中医药治疗恶性肿瘤的理论基础

中医药治疗恶性肿瘤经过几千年中华文化的沉淀、历代名中医的经验传承和发扬创新，在整体观指导下辨证论治，以扶正祛邪、调和阴阳为总则，有效抑制恶性肿瘤的生长与发展，具有切实有效、无明显副作用、经济实惠等特点，取得了确切的临床效果，越来越受到重视。蛋白质组学是研究细胞、组织或身体在特定时空维度上整体表达的所有蛋白质的科学[13]。其特点是在机体不同的细胞、组织，或者同一机体的不同生长阶段、机体状态及环境条件下不尽相同，具有整体性、动态性、复杂性的特点[14]，这恰恰与中医学的整体思维和辨证施治相符合[15-17]。因此，将蛋白质组学运用于中医药治疗恶性肿瘤的研究中，对于我们探讨恶性肿瘤的中医证候、中药单药(单体）及经方、验方治病机理，促进中医药现代化具有重要意义[18]。

范芳芳等[19]为了解蛋白质组学在中医药领域的应用，检索并分析了近10年共1350篇文献，揭示蛋白质组学技术作为中医药研究领域的新兴技术，已经极大地促进了中医药的现代化和国际化发展。袁枝花等[20]认为以整体研究为特征的蛋白质组学可高效地发现中药作用靶点，进一步研究中药作用机制。

3 应用蛋白质组学技术研究中医药治疗恶性肿瘤的实践研究

目前，蛋白质组学在中医证候、中药单药(单体）及经方、验方治病机理的研究较多[21]，主要集中在中医证候的本质研究和科学验证方面。

3.1 证候

中医证候是证的外候，是疾病过程中特定阶段的病位、病因、病性、病势及机体抗病能力等全面状态的反映，而其物质基础即蛋白质在微观水平的表达和翻译后修饰。证候蛋白质组学的提出，为整体进行评价证候本质问题提供一个可能。

关于恶性肿瘤的中医证候实质研究方面，周岱翰等[22-23]研究了肺癌病理类型与中医证型的相关性，发现肺鳞癌多属于痰瘀证型，肺腺癌多属于阴虚痰热证型，支气管肺泡癌多属于脾虚痰湿型，并进一步探讨不同蛋白质组学方法用于国内肺癌证型研究的进展情况。赵健等[24]应用蛋白质组学技术研究两类不同中医证型肺癌患者的血清蛋白质谱，筛选出6个血清特异性蛋白质，为建立中医肺癌辨证的蛋白质指纹图谱提供可能。黄争荣等[25]检测了两类不同证型肝癌患者的血清蛋白质指纹图谱，发现2个差异蛋白质，可能是鉴别中医肝癌辩证的血清生物学指标。楚瑞阁[26]将120例肺癌患者分为肺阴亏虚型、气血亏虚型、痰湿蕴肺型、肾阳虚衰型、肺脾气虚型等五种类型，观察并分析表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR）在不同证型中的表达。结果表明EGFR在五型患者中均呈上升的趋势，并且在肺脾气虚、肾阳虚衰及肺阴亏虚三种分型中差异有统计学意义。根据EGFR在肺癌不同证型中的不同表达，临床可给与针对性用药。杨素芳等[27]对肝癌的中医不同证候患者血清蛋白质进行分析，发现肝郁证、湿热证、脾虚证、血瘀证患者中质荷比(M/Z）的蛋白表达下调，阴虚证患者蛋白表达上调；经介入治疗后，肝郁证、湿热证、阴虚证蛋白表达下调，脾虚证、血瘀证蛋白表达上调，提示肝癌的不同证候本质可以体现在M/Z比值的不同。孙珂焕等[28]对26例甲状腺癌肝郁气滞证患者和正常人群唾液蛋白质进行研究，发现与正常人群相比，肝郁证甲状腺癌患者唾液中有差异蛋白29个，其中上调的有11个，下调的有18个。何迎春等[29]采用蛋白质组学技术，寻找不同中医证型鼻咽癌患者癌组织之间的差异蛋白，发现其发病与原发病瘤体中差异表达蛋白有关。丁峰等[30]通过同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ）技术分析原发性肝癌不同中医证型的差异蛋白表达谱，发现肝郁证组中有260个蛋白存在特异性表达，包含124个上调蛋白和136个下调蛋白，主要涉及通路有蛋白酶体、溶酶体、黏附连接等。柴仲秋等[31]对辨证为脾气虚证的直肠肿瘤患者留取术后肿瘤组织和远端正常组织标本，运用iTRAQ定量蛋白质组学比较两种组织的差异表达蛋白，并应用Metascape进行富集和分析。结果发现脾气虚证患者肿瘤组织和远端正常组织表达差异的蛋白总数为140个，上下调差异倍数≥1.6倍的差异蛋白总数为42个；富集分析显示，差异蛋白的生物过程主要集中在平滑肌收缩、气体运输、粒细胞激活等通路中，这些通路对脾气虚证的结直肠肿瘤的形成具有重要作用。

3.2 中药单体和单味药

蛋白质组学在单味中药研究中主要应用于寻找其作用的靶点和通路，还可以通过分析对中药化学成分干预后蛋白表达谱的差异，阐释单体的分子作用机制。

2003年，马兵等[32]观察泽泻对LEWIS肺癌小鼠肺转移灶及血清蛋白质组的变化。结果显示泽泻能够显著减少小鼠肺部转移灶数量，并且能够改变荷瘤小鼠血清蛋白质组成。2006年和2007年，Wang等[33-34]应用蛋白质组学技术探索了从湖北黄精中提取的薯蓣素(dioscin）通过触发线粒体氧化应激反应从而诱导人髓系白血病HL-60细胞毒性凋亡的分子作用机制；Ha等[35]通过蛋白质组学技术研究了从远志科植物乌棒子(Polygala caudata）中分离的单体化合物euxanthone诱导小鼠成神经细胞瘤2a细胞分化的分子机制；Wu等[36]利用蛋白质组学技术阐明了台湾民间真菌药材樟芝(Antrodiacamphorata）乙醇提取物抑制非小细胞肺癌A549细胞增殖的分子机制可能与内质网应激反应相关。

2008年和2010年，Yue等[37-39]用蛋白质双向电泳联合质谱鉴定的研究方法发现了21个可能是灵芝中的灵芝酸D在人宫颈癌细胞株HeLa细胞毒性的作用机制中发挥作用的关键差异表达蛋白；并通过蛋白质组学技术阐明了灵芝总三萜(ganoderma triterpenes）联合阿霉素作用于人宫颈癌HeLa细胞毒性的分子机制，即可能通过增加氧自由基和DNA损伤以及诱导肿瘤细胞凋亡。

抗肿瘤药物藤黄酸是从藤黄属植物中分离得到的。2016年，Guo团队利用蛋白质组学技术研究了藤黄酸抗人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和人宫颈癌HeLa细胞侵袭作用的机制。研究显示[40]，MDA-MB-231细胞中有23种可能的靶蛋白。另一项研究发现[41]，藤黄酸发挥抗HeLa细胞的重要靶点是波形蛋白。在对肝细胞癌的作用机制蛋白质组学分析研究中发现[42]，藤黄酮K(同样分离于藤黄属植物）干预组肌动蛋白结合蛋白profilin 1为其作用靶点。

2019年，Hou等[43]采用蛋白质组学技术阐明了青蒿素的半合成衍生物双氢青蒿素的抗肝癌机制，即上调APOA1蛋白的表达，以及下调GALNT10蛋白的表达。2021年，张璐莹等[44]采用iTRAQ蛋白组学技术来揭示黄当归醇(XAG，一种从日本草药明日叶中分离出来的查耳酮类物质）处理的肝癌HCC细胞中蛋白水平的变化及其影响通路。结果表明，XAG抑制了HCC的癌变和进展。在机制层面，发现有10个基因可能参与了XAG的抗肿瘤特性。这些数据支持了XAG可以作为HCC潜在的抗肿瘤候选药物的观点。

3.3 中药复方

临床上，中药治疗以复方为主。中药复方药味众多，且讲究君臣佐使，配伍应用后，既有单味药物主要化学成分的生物活性，还有数味中药的配伍规律和协同作用，加剧了研究的复杂性和困难。因此，中医药研究要想取得突破性进展，必须依靠系统生物学技术[8，45-46]。应用蛋白质组学除了可以直接观察药物作用后机体或者病灶蛋白质数量、种类的变化，同时还可分析复方中各药物及其成分之间的协同作用。

2004年，郭平等[47]利用蛋白质组学技术，报道四物汤(组成为熟地、当归、白芍和川芎）能够抑制并改善放疗所致的血虚证小鼠骨髓中10种上调蛋白和5种下调蛋白，并由此促进造血细胞的生长和分化，达到补血作用。唐发清等[48]利用蛋白质组技术探究了益气解毒颗粒(组成为黄连、天花粉、臭牡丹等）杀伤鼻咽癌细胞的分子机制，发现治疗组的平均蛋白质数为(1 120±89）个，对照组为(1 281±102）个，差异蛋白质有673个，其中有218个蛋白质表达增强，有455个蛋白质表达下降。益气解毒颗粒杀伤鼻咽癌细胞的作用机制可能与这些蛋白质的差异表达有关。

2008年陈竺院士团队[49]应用蛋白质组学技术探索复方黄黛片治疗急性早幼粒细胞性白血病多成分、多靶点协同作用的机制，并将“君臣佐使”的配伍原则用现代医学的方法进行了详细的阐述，在提供中药复方作用机制研究模板的同时，也得到了国际主流科学研究界的高度评价。

2012年，陈天池等[50]应用蛋白质组学技术，研究消痰散结方对人胃癌MKN-45裸鼠皮下移植瘤模型血清蛋白质组表达的影响。将实验动物分为正常组、模型组、干预组三组。结果三组间共有差异表达蛋白点9个，与正常组比较，在模型组中表达上调、在干预组表达回调至正常组水平的3个蛋白为结合珠蛋白、泛素蛋白连接酶、组蛋白甲基转移酶；与正常组比较，在模型组中表达下调、在干预组表达恢复至正常组水平的6个蛋白中3个被鉴定为载脂蛋白A1、过氧化物酶1、超氧化物歧化酶。推理消痰散结方抗肿瘤作用的重要机制可能是对载脂蛋白A1、过氧化物酶1等功能蛋白表达的全面调节。

2015年，李华成等[51]应用蛋白质组学技术，分析膈下逐瘀汤加减方(GXZY）含药血清作用人肝癌细胞SMMC-7721的差异蛋白质不同表现。用质谱法分析了治疗组和对照组的蛋白质电泳图谱，共鉴定出6个蛋白点。治疗组有5个下调蛋白质点，1个上调蛋白质点。提示GXZY含药血清可能引起人肝癌细胞SMMC-7721蛋白质质谱表达差异，成为其发挥疗效的靶点。

2019年，Chen等[52]应用蛋白质组学技术，发现大黄䗪虫丸可抑制大肠癌的生长和转移，其机制是降低肝脏CC趋化因子配体2和CC趋化因子受体2的表达。2021年，霍炳杰等[53]基于TMT蛋白质组学探讨华盖散对H1688和A549肺癌细胞增殖、凋亡影响的作用机制。结果显示，华盖散可抑制H1688和A549肺癌细胞增殖，诱导凋亡。蛋白质组学分析表明，华盖散干预能够引起112个蛋白的差异表达，其中UHRF1、CRYAB、ING3和PAWR有可能为其治疗肺癌的生物标志。

4 存在问题及展望

蛋白质组学发展至今，相较于诸如基因组学等数据密集型学科，蛋白质组学的数据库尚不够发达，由此导致数据分析不够全面[54]；操作技术在自动化操作、灵敏度检测方面存在某些缺陷；由于仪器价格高昂使得相关技术的推广受到限制；蛋白质组学方法标准尚未统一，各实验室的结果不能很好地重复；对机制的解释不够全面，需要联合其他组学技术，并结合多学科进行深入的研究；实验室检测LDT项目的标准化严重不足等[55-56]。虽然蛋白质标志物的重要性不断得到证实，但被发现的大多数潜在诊断标记物还没有在大量的临床实践中得到进一步的验证。美国获得许可或批准的蛋白质标记物每年仅为1.5个[57]。但是，仍然可以看到，对于研究中医中药治疗恶性肿瘤，蛋白质组学在揭示中医证候本质、中药作用靶点、中药复方作用机制等方面已有突破。

至于如何才能更好地应用蛋白质组学技术为研究中医药治疗恶性肿瘤服务，应该考虑以下几个途径。一是借助网络药理学、生物信息学，提供更先进的外部技术，如开发一整套适合复杂的中药体系作用机制的高通量蛋白质组学研究方法，蛋白质网络结构的研究等。二是可以提升中药作用机制的研究深度，重点开展中药作用靶点蛋白翻译后修饰的研究。

随着蛋白质组学技术的不断发展，通过对中医药治疗恶性肿瘤量效、时效关系等的动态观察，未来研究需对揭示中医药治疗恶性肿瘤的物质基础、治疗靶点和途径、中医药受益优势人群等提供更加精确的判辨机制；另外，需将蛋白质组学与基因组学、转录组学和代谢组学等多组学整合，发现其中相关规律和相互联系，从整体水平阐释中医药的作用靶点和作用机制。