铁死亡的分子机制及其在肿瘤治疗中的作用

曾婷，高磊，吕志平

南方医科大学中医药学院，广东 广州 510515

铁死亡是近年来发现的一种全新的氧化性、非凋亡性的细胞程序性死亡形式，其在形态学、遗传学和分子生物学等方面都不同于凋亡、自噬和坏死等其他细胞死亡方式[1]。铁死亡的主要特征是发生于线粒体内的铁依赖性脂质过氧化物损伤诱导的细胞死亡，其生化特点主要表现为胱氨酸/谷氨酸转运蛋白系统的抑制以及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化增加，铁超载引起的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS）累积，脂质过氧化产物增多等。铁死亡具有独特的形态学和生物能量学特征，其形态学特征是细胞膜不破裂但质膜起泡、线粒体缩小、线粒体膜密度增加、线粒体嵴减少或消失、细胞核大小正常但染色质不凝聚。

研究发现多种信号通路及细胞器参与了铁死亡的调节。目前研究发现一系列小分子和中药如Erastin、青蒿素(Artemisinin，ART）等，能够诱导多种癌细胞发生铁死亡[2]。这些发现提供了通过遗传或药物干预铁死亡来治疗癌症的可能性，这在医学研究上是非常有意义的。与正常细胞相比，肿瘤细胞内铁离子的含量更高，且肿瘤细胞内ROS水平通常较高，同时，RAS突变的癌细胞对Erastin或RSL3诱导的铁死亡非常敏感，因而铁依赖性ROS累积有关的铁死亡与肿瘤疾病的联系更加密切[3]。因此，本文综述了铁死亡的发生机制以及参与铁死亡调控的细胞器。同时，还从几个方面讨论了铁死亡在治疗癌症以及克服癌细胞耐药性方面的潜在应用。

1 铁死亡的发生机制

谷胱甘肽、脂质和铁代谢都与铁死亡的发生密切相关。

1.1 谷胱甘肽(Glutathione，GSH）代谢

小分子抗氧化剂GSH是由氨基酸，谷氨酸，甘氨酸和半胱氨酸组成的三肽，是体细胞中最重要的小分子抗氧化剂之一。在生理条件下，细胞通过胱氨酸/谷氨酸反向转运体(Cystine and glutamate transport system，Systeam Xc-）摄入胱氨酸并被还原为半胱氨酸，同时排出谷氨酸，以维持胱氨酸摄入和谷氨酸排出的平衡[4]。胱氨酸在细胞内与谷氨酸、甘氨酸经过多步酶促反应合成GSH，故Systeam Xc-的抑制会导致GSH合成不足。GSH可在谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione peroxidase 4，GPX4）的作用下转化为氧化型谷胱甘肽(Glutathione oxidized，GSSG），还原活性氧和活性氮，从而减轻氧化应激损伤[5]。选择性抑制Systeam Xc-时，胱氨酸的吸收减少，机体内GSH的合成减少，导致脂质过氧化物堆积。GPX4是铁死亡中GSH代谢和脂质过氧化作用的关键点，也是铁死亡的关键上游调节因子。因此，Systeam Xc-的抑制、GSH合成不足或耗竭以及GPX4失活都将导致细胞内脂质过氧化物累积，引起铁死亡。

1.2 脂质代谢

脂质过氧化反应(lipid peroxidation，LP）反映了生物膜、脂质和其他含有脂质的分子相关的多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFA）被氧化物如ROS氧化形成脂质过氧化产物(Lipid PerOxide，LPO）的过程。目前研究表明，PUFA氧化物的积累是铁死亡的标志，其积累过程主要涉及脱氧抑制[主要指GPX4和铁死亡抑制蛋白1(Ferroptosis suppressor protein 1，FSP1）]和由铁及一系列酶催化导致的过氧化增强[6]。花生四烯醇(Arachidonic acid，AA）和肾上腺素(Adrenaline，AdA）可被酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(Acyl-CoA synthetase long-chain familymember 4，ACSL4）酯化为脂酰辅酶A衍生物，再经溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3(Recombinant lysophosphatidylcholine acyltransferase 3，LPCAT3）酯化为磷脂酰乙醇胺(Phosphatidyl ethanolamine，PE），继而被脂加氧酶(lipoxygenases，LOXs）氧化为毒性脂质氢过氧化物。LOXs是一种含铁的酶，是铁死亡中最重要的脂质氧化酶[7]。因此，ACSL4、LPCAT3和LOXs的激活会导致过度的脂质过氧化，导致铁死亡的发生。

1.3 铁代谢

过量的铁会导致组织损伤，增加罹患癌症的风险。造成铁生物毒性的最重要机制在于细胞内的过多的Fe2+发生Fenton反应，导致ROS累积，羟基自由基的大量产生，从而导致细胞蛋白质，脂质和DNA的损伤。干预铁的吸收和代谢已成为治疗肿瘤等疾病的方法。铁基纳米粒子的应用可以诱导肿瘤细胞发生铁死亡，从而抑制肿瘤的生长[8]。总而言之，肿瘤细胞可通过调控铁代谢途径实现细胞内铁含量增高，从而使得癌组织对铁死亡的方式更加敏感。研究表明，可以通过敲除细胞表面转铁蛋白受体(Transferrin receptor，TFRC）来防止细胞内铁超载或者通过上调胞浆铁蛋白来增加惰性池中铁的储存，抑制铁死亡的发生[9]。同样，抑制调节铁代谢的转录因子铁反应元件结合蛋白 2(Iron responsive element binding protein 2，IREB2），能减少铁死亡[1]。相反，通过敲除溶质载体家族40成员1(又称细胞膜铁转运蛋白，Solute carrier family 40 member 1，SLC40A1）来阻断细胞内的铁输出则会加速神经母细胞瘤细胞中Erastin诱导的铁死亡[10]。综上所述，铁代谢途径和铁蛋白吞噬是调控铁死亡的关键。

2 细胞器在铁死亡中的作用

细胞器是细胞的重要组成部分，并具有维持细胞内稳态的重要功能。然而，在应激条件下细胞器的功能障碍会促进细胞死亡过程。有研究表明线粒体，溶酶体和内质网在铁死亡发生的过程中起着重要作用。本文接下来将论述不同细胞器对铁死亡的具体调控作用。

2.1 线粒体

线粒体是细胞能量代谢、氧自由基产生的主要场所，长期以来一直被认为是细胞死亡的调控中心，与细胞程序性死亡过程密切相关。目前，线粒体在铁死亡中的作用仍然存在很大争议。Dixon等人和Gao等人的研究表明，抑制线粒体三羧酸(Tricarboxylic acid，TCA）循环或功能性线粒体电子传输链(Electron transport chain，ETC）可减轻半胱氨酸剥夺导致的铁死亡[11]。除此之外，线粒体脂质也是铁死亡过程中脂质过氧化物产生的重要来源。当半胱氨酸缺失时，细胞会通过谷氨酰胺分解来进行代谢，线粒体内TCA增强，脂质ROS的产生增多，线粒体膜超极化并最终崩溃，从而诱导细胞铁死亡。此外，线粒体脂肪酸代谢基因，包括柠檬酸合酶和酰基辅酶A合成酶家族成员2(Recombinant acyl coenzyme A synthetase long chain family，member 2，ACSF2），可能是 Erastin诱导的铁死亡发生所必需的基因。所有这些发现都将线粒体与铁死亡的发生紧密联系在一起。

2.2 溶酶体

溶酶体是一种典型的富含多种酸性水解酶的细胞器，参与细胞分解代谢、细胞信号传导、质膜修复和细胞程序性死亡等多种生理过程。有研究发现，溶酶体在铁死亡的诱导过程中也起着一定的作用。在Erastin或RSL3诱导HT1080细胞铁死亡中，检测到溶酶体ROS是脂质ROS的主要来源，溶酶体活性的抑制剂可以防止溶酶体ROS产生，从而减少铁死亡相关的ROS累积[12]。溶酶体活性通过减弱细胞内转铁蛋白的运输或铁蛋白的吞噬降解来影响细胞内的铁供应。Gao等人发现，抑制溶酶体组织蛋白酶B可以抑制细胞内GSH的耗尽，减少ROS的累积，从而抑制Erastin诱导的细胞铁死亡[13]。最近的一项研究表明铁死亡是一种自噬性细胞死亡，自噬可以促进ROS的产生和脂质过氧化物的积累[14]。这进一步揭示了溶酶体在铁死亡中的重要作用，因为溶酶体是蛋白质聚集体自噬降解的主要细胞器。

2.3 内质网

为避免内质网中未折叠蛋白质的过度累积，真核细胞能激活一系列信号通路来维持内质网稳态，这个过程称为内质网应激(Endoplasmic reticulum stress，ERS）。Erastin可以上调ERS反应基因，诱导ERS的发生[15]。激活转录因子4(Activating transcription factor 4，ATF4）是ERS参与铁死亡激活的主要信号转导途径，其可增加阳离子转运调控样蛋白1(Cation transport regulator like protein 1，CHAC1），促进GSH的降解从而诱导铁死亡的发生[16]。而凋亡调节因子PUMA也是ATF4下游，在铁死亡诱导剂ART诱导的ERS中也被上调[17]。有证据表明，Ferrostatin-1(Fer-1）和Liproxstatin-1(Lip-1）不能通过抑制脂质过氧化来减少Erastin诱导的ERS[17]。

3 铁死亡在癌症治疗中的作用

阐明铁死亡潜在机制的最终目的是获得更好的癌症治疗选择。因此，基于铁死亡的分子调控机制，我们可以特异性靶向铁死亡的关键调节因子(如Systeam Xc-，GPX4），以触发铁死亡。本文列出了一些利用铁死亡诱导剂及中药作为治疗癌症的武器的新发现。

3.1 铁死亡相关的分子载体对癌细胞的作用

尽管研究表明，RSL能够有效诱导癌细胞发生铁死亡，但是由于其水溶性差、有肾毒性等毒副作用，并不能够直接用于临床中的癌症治疗。近期，已经有研究表明外泌体和纳米系统在治疗癌症方面发挥了极大的作用。此外，纳米颗粒因其良好的亲水性和靶向性，在疾病治疗方面具有独特优势，纳米颗粒联合靶向铁死亡的药物或物理方式是新的极具潜力的治疗策略。

近年来，大量研究发现，外泌体具有免疫原性低、生物相容性高、效率高等优点，在药物传递方面具有较好的优势。一个研究小组构建了一种叶酸(folic acid，FA）标记的Erastin负载的外泌体制剂(erastin@FA-exo），以靶向叶酸受体过表达的三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC）细胞。与游离的Erastin相比，Erastin@FA-exo提高了MDA-MB-231细胞对Erastin的摄取率，并通过抑制Systeam Xc-促使该细胞发生铁死亡[18]。另一个纳米系统称为Erastin和雷帕霉素结合的铁蛋白纳米粒子，是一种由Abraxane启发的纳米药物。当铁蛋白纳米粒子被癌细胞吞噬时，纳米系统可以释放Erastin和雷帕霉素，分别抑制Systeam Xc-和自噬，从而导致肿瘤细胞发生铁死亡[19]。此外，包裹p53质粒的金属-有机网络(MON-p53）与铁离子结合也可通过释放铁和p53质粒抑制Systeam Xc-而诱导细胞铁死亡的发生。在患癌的小鼠中，MON-p53治疗既抑制了肿瘤的生长，又延长了小鼠的寿命[20]。另外，一种使用HKUST-1的新型级联铜基金属有机框架治疗纳米催化剂，通过整合环加氧酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2）抑制剂美洛昔康和化疗药物索拉非尼来放大肝细胞癌的治疗[21]。

3.2 癌症干细胞

癌症干细胞(Cancer stem cells，CSCs）具有自我更新和无限增殖的能力，对维持癌症的增殖，耐药性，转移和复发至关重要。癌症干细胞也是重要的治疗靶标。William的团队发现了一种新化合物，该化合物可以抑制Systeam Xc-，从而诱导癌症干细胞铁死亡[22]。敲低铁蛋白基因可以抑制胶质母细胞瘤CSCs的生长，并损害乳腺癌细胞的茎样表型[23]。在卵巢CSCs中，铁存储蛋白铁蛋白和铁转运蛋白(Ferroportin，FPN）的水平均降低，同时，与非致瘤性卵巢干细胞相比，卵巢CSCs对铁死亡的敏感性更高[24]。沙利霉素(Salinomycin，SAL）是一种聚醚型离子载体抗生素，研究发现，负载沙利霉素的金纳米颗粒可以诱导CSCs发生铁死亡[25][26]。

3.3 中医药在癌症中对铁死亡的治疗作用

近些年对中药的深入研究表明多种来源的中药具有广泛的抗肿瘤活性，此外中药在抗肿瘤治疗过程中毒副作用低、耐药性小、有效延长患者生存期和提高生存率等优点也成为其优势所在。目前围绕中药及其化学成分诱导肿瘤细胞铁死亡的研究正大量开展，并取得了不凡的研究进展。目前中药及其活性成分在肿瘤细胞铁死亡发挥重要作用，主要表现在以下几个方面：①选择性地增加脂质过氧化水平诱导肿瘤细胞铁死亡形成，而对正常细胞无影响；②通过调节特定的信号通路，如Nrf2抗氧化剂应答元件(Nrf2-antioxidant response element，ARE）-Kelch样ECH相关蛋白-1(Kelch-like ECH-associated protein-1，Keap1）途径，抑制肿瘤细胞增殖，促进铁死亡；③调节铁相关蛋白，介导铁代谢及溶酶体铁诱导RAS突变的肿瘤细胞，增加铁死亡。

最近的研究表明，ART和双氢青蒿素(Dihydroartemisinin，DHA）对乳腺癌、肺癌、胰腺癌、肝癌、卵巢癌和神经胶质瘤具有化学治疗作用。ART及其衍生物是铁死亡诱导剂，能够有效诱导各类肿瘤细胞铁死亡，从而抑制癌细胞侵袭和迁移，发挥抗肿瘤的作用[27]。ART主要通过触发细胞内ROS产生、促进铁蛋白的溶酶体降解和调节System Xc-/GPX4轴来诱导胰腺导管腺癌细胞铁死亡。同时，ART还刺激反馈抑制途径。青蒿琥酯(Artesunate，ARS）和蒿甲醚(Artemether，ARM）是ART的衍生物，可转化为活性代谢物DHA。ARS主要能通过增加卵巢癌细胞、头颈部癌细胞和胰腺导管腺癌ROS水平，促进脂质过氧化的累积诱导铁死亡形成，而对正常细胞无明显影响[28-30]。DHA可诱导头颈部癌细胞铁死亡和凋亡。DHA不仅可通过降低GPX4蛋白诱导铁死亡抑制肝细胞癌细胞生长，并可以通过激活JNK及Beclin表达诱导自噬显著抑制肿瘤细胞活力[31]。DHA还可通过促进和展开蛋白反应 诱导CHAC1表达上调，触发原发性肝癌细胞铁死亡[32]。还有研究人员开发了铁供应纳米载体来封装ART。结果表明纳米载体系统的效率高于ART[33]。此外，载有ART的纳米粒子为静脉内治疗提供了显著的优势[34]。这些载有ART的递送系统提高了治疗效果并降低了毒性。

来源于胡椒科植物荜茇Piper longum的干燥根的荜茇酰胺(Piperlongumine，PL），又称荜茇明碱，为生物碱类化合物，是荜茇发挥药理作用的物质基础之一。大量研究表明PL可通过提高ROS水平，调节铁代谢诱导肿瘤细胞发生铁死亡，发挥抗肿瘤效果，且其对正常细胞没有影响。PL可与Keap1直接相互作用介导血红素加氧酶1(Heme oxygenase 1，HO1）表达上调，选择性地增加乳腺癌细胞ROS的产生量和细胞的死亡率，但不会影响乳腺正常细胞[35]。另有研究表明，PL选择性杀伤肝癌细胞，诱导肝癌细胞发生铁死亡，并通过ROS-ER-MAPKs-CHOP轴抑制肝癌细胞迁移/侵袭[36]。另外，PL还可以调节人胰腺癌细胞、人结肠癌细胞和头颈部癌细胞的ROS水平，诱导癌细胞发生铁死亡，抑制癌细胞活性，起到抗癌作用[37，38]。一种高效的铁死亡/细胞焦亡双诱导纳米递送系统Tf-LipoMof@PL，是由PL负载在涂有带有转铁蛋白装饰的DOPE pH敏感脂质层的含铁MOF中组成。这个系统可以诱发芬顿反应，导致肿瘤细胞内ROS增加，引起细胞发生铁死亡和焦亡，取得有效的抗癌效果[39]。

另外，更多的研究发现中药及其有效活性成分对肿瘤细胞铁死亡具有诱导作用。天然产物β-榄香烯(一种从中药莪术中分离出的生物活性化合物）是一种新的铁死亡诱导剂，β-榄香烯和西妥昔单抗联合治疗可通过诱导铁死亡和调节上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT）抑制KRAS突变的结直肠癌细胞的生长和淋巴结转移[40]。丹参酮IIA是一种从中草药丹参的根茎中分离出来的药理活性成分，其可通过诱导p53上调介导的铁死亡来抑制胃癌的增殖[41]。Erianin是石斛提取物中的一种新型二苄基化合物，通过钙/钙调蛋白依赖性铁死亡抑制肺癌细胞的生长和迁移，有望成为肺癌治疗的前瞻性化合物[42]。石蒜碱通过降低GPX4的表达增加ACSL4的水平诱导肾细胞癌(Renal cell cancer，RCC）细胞发生铁死亡，从而抑制RCC细胞的增殖[43]。同时石蒜碱还可诱导RCC细胞中MDA的表达，并降低GSH/GSSG比值。葫芦素B(Cucurbitacin B，CuB）是一种广泛使用的三萜类分子，具有多种生物活性。CuB导致人鼻咽癌细胞内铁离子的积累和谷胱甘肽的消耗，启动铁死亡的发生，同时通过抑制细胞微管聚合、阻滞细胞周期和抑制迁移和侵袭在体外表现出抗肿瘤作用[44]。穿心莲可通过激活结直肠癌细胞发生铁死亡和抑制β-连环蛋白/Wnt信号通路增强5-氟尿嘧啶治疗结直肠癌的效果，降低耐药性的 发 生[45]。 猕 猴 桃(Actinidia chinensis Planch，ACP）是猕猴桃属植物中华猕猴桃，已被批准为临床广泛使用的抗肿瘤药物，可通过调节细胞凋亡、铁死亡和间充质表型来治疗胃癌[46]。中成药疏肝宁注射液依赖于HO1的表达促进不稳定铁池中的铁积累，从而导致三阴性乳腺癌细胞发生铁死亡，起到抗癌活性作用[47]。化瘀祛痰方可以通过调控肝细胞铁死亡相关因子，降低高脂合并肝癌小鼠肝脏细胞脂质过氧化、缓解肝脏脂质沉积，进而保护小鼠肝脏[48]。

4 小结

细胞程序性死亡是生物研究和医学研究的热点问题，而靶向细胞死亡过程是肿瘤治疗中常用的方法。然而，目前诱导铁死亡的化合物只对某些肿瘤细胞有效，不同种类的癌症似乎对铁死亡有不同的敏感性。努力了解不同组织肿瘤对铁死亡的敏感性，对于铁死亡在肿瘤治疗中的临床应用实践具有重要意义。关于如何在体内精确诱导铁死亡，已经发现的铁死亡的关键调节因子提供了重要的治疗靶点。目前临床上常用的抗肿瘤药物具有选择性差、毒副作用强以及易产生耐药等缺点，严重限制了其疗效的发挥。根据中医药的特性，研究中药及其特定成分对肿瘤铁死亡的作用，发现有效的抗肿瘤成分，联合多领域、多学科，通过纳米技术装载铁死亡诱导剂、铁死亡过程的反应物或者中药制剂靶向肿瘤部位，使药物浓度在肿瘤部位聚集，可能会为基于铁死亡的癌症治疗带来新的选择。中药干预铁死亡的探索还处于起步阶段，但目前已有研究通过纳米技术装载中药治疗肿瘤，展现出了不凡的研究前景。总之，铁死亡作为一种新的程序性细胞死亡过程，具有独特的特点，在肿瘤治疗中显示出巨大的潜力。