未成熟卵母细胞体外成熟在生育力保护中的应用进展

程姣姣 阮祥燕 杜 娟 谷牧青

(首都医科大学附属北京妇产医院/北京妇幼保健院内分泌科，北京 100026)

随着癌症诊断与治疗技术的进步，儿童、青少年、年轻女性癌症患者的5年存活率明显提高，有的5年存活率可高达90%以上[1]，但抗癌治疗导致早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency, POI)的发生率明显增加。影响因素包括年龄、化学药物治疗(以下简称化疗)药类型、剂量、放射治疗(以下简称放疗)部位、累积剂量等[2]。目前的生育力保护(fertility preservation, FP)方法主要包括卵巢组织冻存(ovarian tissue cryopreservation, OTC)、卵母细胞冻存和胚胎冻存[3]。对于青春期前女童和放射治疗联合化学药物治疗(以下简称放化疗)无法延迟的女性来说，OTC是唯一的FP方法[4]。卵巢组织冻存每次移植后卵巢功能恢复率可高达77%～95%，移植后卵巢功能恢复率累积可达100%，妊娠率约55%，活产率约为40%[5]。截止到2021年，全球已有200多例婴儿通过此技术诞生[6]，越来越多研究[7-8]表明OTC技术安全、有效，2019年美国生殖医学学会(American Society of Reproductive Medicine, ASRM)[4]也声明OTC技术不再是试验性技术。

卵巢转移风险很高的癌症患者因再引入恶性细胞的风险高，不适合进行卵巢组织移植，但国际已有多个团队移植了白血病患者的卵巢组织，没有复发报道[9-11]。未成熟卵母细胞体外成熟(invitromaturation, IVM)获取第二次减数分裂中期(metaphase II, MⅡ)卵母细胞能安全地恢复生育力。成熟卵母细胞及卵母细胞玻璃化冷冻已成为临床常规，并且对IVM培养系统不断优化以获得更高的成功率。卵巢组织卵母细胞体外成熟(invitromatured ovarian tissue oocytes, OTO-IVM)也越来越受到重视，可额外增加患者获益。本文主要围绕IVM及其优化以及OTO-IVM在FP的应用进展。

1 卵母细胞体外成熟

IVM是指生长卵泡来源的未成熟卵丘卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes, COCs)体外培养成熟至MⅡ期的过程。1994年Trounson等[12]报道了全球首例IVM活产，产妇是一名多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)患者。截至目前，全球已有5 000多名IVM婴儿出生[13]，IVM作为体内成熟卵母细胞体外受精(invitrofertilization, IVF)的替代方法的潜在应用受到越来越多的关注，IVM刺激周期更短，注射更少，相关药物和监测成本更低，更减轻患者的负担[14]。IVM最初引入临床是作为一种比传统卵巢刺激更安全的选择，IVM的候选患者包括卵巢过度刺激综合征(ovarian hyper-stimulation syndrome, OHSS)风险高的患者，如PCOS或卵巢多囊样改变。研究[15]显示PCOS不孕患者应用IVM，成熟率高达84%，受精率高达80%，每个周期的临床妊娠率高达50%。

2021年ASRM声明IVM技术不再被认为是试验性的[16]。窦卵泡数(antral follicle counting, AFC)高的患者是IVM技术好的候选者，但应意识到与IVF比，囊胚形成率、胚胎植入和妊娠率可能降低。卵母细胞胞质内单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)可与IVM联合应用[17]。由于IVM活产数相对较少，关于IVM的畸形和发育安全性尚不能充分评估，但初步研究是令人放心的。

IVM的适应证已扩大到生育力保护和罕见情况，如卵巢抵抗综合征(resistant ovary syndrome, ROS)[18]或反复缺陷的卵母细胞成熟。ROS的发病机制是卵泡刺激素受体(follicle stimulating hormone receptor,FSHR)基因突变[19]，卵泡对内源性或外源性FSH无反应，特征是原发性闭经，乳房、腋毛和阴毛发育良好，血清卵泡刺激素(follicle stimulating hormone, FSH)和黄体生成素(luteinizing hormone, LH)浓度升高，而AFC和抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone, AMH)浓度正常，卵泡很少发育到窦卵泡期，很难自然受孕，通常不得不接受卵子捐赠。已有研究[20-21]报道在ROS患者中采用IVM技术实现妊娠和活产，ROS患者采用IVM技术的活产率约为33.3%，IVM为ROS患者获得自身生物学的后代提供了可能。

2 卵巢组织卵母细胞体外成熟

2.1 卵巢组织卵母细胞体外成熟概况

COCs最早是经阴道卵泡抽吸法收集，新方法包括腹腔镜/开腹时从卵巢或对侧卵巢原位抽吸卵泡，以及在卵巢皮质冻存时从切除的卵巢组织或处理卵巢组织后的培养液中抽吸体外卵泡，后一种方案被称为OTO-IVM，是一种很有前途的肿瘤患者FP方法，被用以最大限度地保护生育力[22]。收集途径的不同，收集COCs的成熟度不同，从阴道抽吸卵泡收集的COCs来自较大的卵泡，因此更成熟，而从切除的卵巢组织中或从皮质准备过程体外回收的COCs来自小窦卵泡(small antral follicles, SAF)，因此更不成熟。在卵巢组织取材前经超声引导下取未成熟卵母细胞，或者在卵巢组织取材时从原位的对侧卵巢中抽吸肉眼可见的卵泡，结合从离体卵巢组织中获取的未成熟卵泡，可增加整体的获取未成熟卵母细胞数[23-24]。

OTO-IVM最先由Revel等[25]提出，可以最大限度地保护接受卵巢切除术的患者的生育力[26]。OTO-IVM可以在没有任何卵巢刺激且在月经周期任意时间获取未成熟卵母细胞，同时还可以与其他手术相结合。很多原始卵泡主要集中于卵巢皮质中，因此将卵巢髓质去除，将皮质切成8 mm×4 mm的皮质片，然后慢速程序化冻存或玻璃化冻存，往往在卵巢组织处理的培养液中含有相当多的未成熟卵母细胞，应收集通过IVM技术成熟后冻存，可为将来提供安全的配子，OTO-IVM技术对于卵巢组织移植恶性细胞污染风险高的癌症患者是一个选择。

无论是从卵巢表面可见的窦卵泡(直径3～5 mm)，还是从卵巢组织处理后的盘子中脱落的小卵泡(直径0.5～6.0 mm)和中卵泡(直径7～11 mm)分离出的未成熟卵母细胞均具有体外成熟的潜力。在OTC时获取的卵母细胞获得最大体外成熟率有最佳的年龄段，成熟率约29%～38%[27-29]，但也有报道[30]IVM成熟率高达68%。卵巢组织低温转运以及较长的转运时间与较低的IVM成熟率有关[31]，但卵巢组织转运不应该被认为是OTO-IVM的限制，卵巢组织转运对卵母细胞发育能力的影响仍不能确定，需进一步评估[32]。目前已有5例健康婴儿通过此技术诞生[33-34]。

研究[28]表明，OTO-IVM可以保存较高数量的成熟卵母细胞和胚胎，但妊娠率较低，妊娠结局较差，建议该方法保留给有较高AFC的患者，并且不能取代卵巢组织移植。大约需要20个MⅡ期卵母细胞才能获得1个活产婴儿[35]，OTO-IVM可以作为OTC的补充方法，但IVM不能被推荐为单一的生育力保护方法。OTO-IVM患者中约42%只能获得≤1个的MⅡ期卵母细胞。OTO-IVM方法耗时且目前还没有可用于0.5～6.0 mm小卵泡的完善培养系统，还未纳入临床常规实践。尽管OTO-IVM前景好，但证据仍少，验证确认重复性是至关重要的，包括对OTO-IVM后出生孩子的随访。

2.2 青春期前卵巢组织卵母细胞体外成熟

卵巢组织冻存是青春期前女孩保护生育力的标准方法。白血病是青春期前女童进行卵巢组织冻存的常见诊断，因此为青春期前女童开发体外培养的方法是非常重要的。研究[36]显示，青春期前的卵巢含有很高比例的异常卵泡。在<6岁和≥30岁患者中IVM成熟率极低(<10%)，有研究[37]表明月经初潮前患者IVM成熟率(24.7%)明显低于月经初潮后的患者(31.0%)。开发IVM系统的主要挑战之一是根据不同阶段的卵母细胞需求调整培养条件，因为不同年龄和青春期成熟阶段的卵泡数量有显著差异，青春期前女孩的卵泡在体外表现出与成人不同的生长轨迹，因此，为成人开发的培养系统可能不适用于青春期前女童[36]。

3 卵母细胞体外成熟的优化研究

3.1 获能卵母细胞体外成熟

卵母细胞成熟过程是复杂的，需实现核和胞质成熟。核成熟包括染色体聚集、分离和极体排出，细胞质成熟包括细胞器的重新分布和细胞骨架细丝的动态变化，协调才能保证卵母细胞的发育能力，IVM成熟率低与胞质和胞核非同步成熟有关。在体内，减数分裂停滞为胞质成熟提供了必要的时间，在LH浓度激增后恢复减数分裂。一旦COCs从卵泡中释放出来，减数分裂就会恢复，与此同时，卵母细胞失去了与卵丘细胞的缝隙连接，停止了营养和信号分子的供应，使得细胞质不成熟，意味着卵母细胞的细胞器具有生发泡(germinal vesicle, GV)期的典型结构和定位[38]。

细胞核和细胞质不同步的问题可以通过实施双相体外成熟系统来解决，一种提高卵母细胞成熟潜力的预成熟培养(prematuration culture, PMC)或“获能”(capacitation, CAPA)，该方案称为“CAPA-IVM”[39]。第一步是卵母细胞暂时停止减数分裂，并延长卵母细胞与卵丘细胞之间的相互作用，卵母细胞的获能依赖于与卵丘细胞的紧密相互作用，第二步，减数分裂恢复，COCs最终成熟。

第一步，在PMC培养液中添加C型利钠肽(C-type natriuretic peptides, CNPs)，使人卵母细胞处于减数分裂停滞状态。CNPs是一种由壁层颗粒细胞产生并分泌到卵泡液中的生理性卵母细胞成熟抑制剂，是卵母细胞中有效的抑制磷酸二酯酶3(phosphodiesterase 3-inhibitor, PDE3)的天然分子，被证明更好地保留了卵丘与卵母细胞的相互作用，这一步骤称为获能[40]。CNPs与卵丘细胞表达的利钠肽受体2(natriuretic peptide receptor 2, Npr2)结合诱导环磷酸鸟苷(cyclic guanosinc monophosphate, cGMP)的生成，cGMP通过缝隙连接通讯(gap-junctional communication, GJC)进入卵母细胞，通过竞争卵母细胞特异性PDE3A的水解活性来调节环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)浓度[41]，cAMP浓度对于维持卵母细胞减数分裂停滞非常重要[42]，高浓度的cAMP还有其他机制，cAMP从卵丘细胞通过GJC进入卵母细胞；cAMP由卵母细胞自身通过膜上的G蛋白偶联受体产生[43]。作为对LH的应答，通过降低CNP、Npr2的表达水平以及降低Npr2的鸟苷酸环化酶活性来恢复减数分裂。研究[39]表明，在PCOS患者中，采用CNP作为减数分裂抑制剂的CAPA-IVM比传统IVM系统更能促进胚胎发育，并获得良好的临床妊娠率。研究[44]表明，应用CAPA-IVM系统可提高妇科恶性肿瘤患者的OTO-IVM成功率。CNP介导的CAPA-IVM已被证明能显著提高SAF的IVM成熟率和发育能力[45]。尽管双相IVM已应用于人，但培养液还未商业化，不能保证各中心的效果和安全性是一致的。但双相IVM在临床上的引入被认为是近年来最显著的进展[46]。

3.2 卵母细胞体外成熟其他优化研究

COCs在体外通过增加LH受体的表达以增加对FSH刺激的应答，更容易恢复减数分裂。Cadenas等[47]探讨IVM液中添加不同重组FSH浓度对人卵母细胞IVM的影响及其对周围卵丘细胞关键因子基因表达的影响。从每位患者的髓质中平均可收集到15～36个未成熟卵母细胞，未受到外源性促性腺激素刺激，也没有进入到卵泡选择阶段，可能是研究FSH在人IVM过程中作用的更好起点。研究[47]表明在IVM培养液中加入70 IU/L FSH，通过上调卵丘细胞中LH受体和下调FSHR可促进卵母细胞核成熟。FSH浓度是否会影响卵母细胞的发育能力和生殖结局还有待进一步研究，但有助于开发优化从未受卵巢刺激患者的SAF中提取的卵母细胞的IVM方案，可能是通过在将COCs暴露于LH前采用FSH刺激卵丘细胞中LH受体的表达来实现的。

研究[48]表明，卵泡液中含有激素和生长因子，这些激素和生长因子对卵母细胞IVM非常重要。中期因子是一种通过NOTCH通路发挥作用的生长因子，已被证明加入IVM培养液中可显著提高成熟率。SAF卵泡液蛋白质组学分析，鉴定出2 000多种不同的蛋白质，中期因子是重要的生长因子之一。因此改进和开发更有效的IVM系统是可能的[49]。

在体内，LH激增导致颗粒细胞释放表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)，EGF对围排卵期很重要，包括卵母细胞减数分裂的重新启动。有研究[50]表明在培养液中添加EGF对COCs的IVM有益处。双调蛋白(amphiregulin, AREG)是成熟卵泡卵泡液中含量最丰富的EGF配体，AREG是卵母细胞成熟和能力的一个有用的标志物和重要的调节因子[51]。有研究[52-54]探讨双调蛋白在CAPA-IVM中的潜在应用，结果表明双调蛋白在触发卵母细胞成熟和发育过程中有益，包括更快地激活排卵级联，促进氧化还原动态平衡和适当的激素合成，然而，还需要更大规模的研究来进一步研究与验证。

Xie等[52]在培养液中添加溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid, LPA)可提高卵母细胞成熟率，LPA是一种膜磷脂代谢物，具有生长因子和激素样作用，存在于人体卵泡液中，浓度为10～25 mmol/L。Lee[53]研究显示白细胞介素6和胰岛素样生长因子1是LPA促进人卵母细胞成熟的关键。研究以人脂肪来源的间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells, ASC)条件培养液(conditioned medium, CM)为补充剂，改善卵母细胞体外发育和后续胚胎发育的IVM培养液，并证明了ASC-CM在猪卵母细胞体外成熟过程中的有效性，ASC-CM中存在的多种生长因子/细胞因子通过调节mRNA/蛋白的表达，积极参与COCs的发育，为进一步建立最优的IVM条件提供了强有力的基础。

虽然活性氧是卵母细胞新陈代谢的天然产物，但超生理水平的活性氧可导致氧化应激，氧化应激可氧化RNA、DNA和蛋白质，破坏细胞膜的完整性，缩短端粒，从而严重损害卵母细胞的功能[54]。目前认为线粒体功能受损可导致活性氧产生过多，但高水平的活性氧也会导致线粒体功能障碍。在卵母细胞成熟过程中，线粒体DNA拷贝数急剧增加，线粒体分布发生明显变化，由于卵母细胞成熟需要大量的ATP来持续转录与翻译，因此获得合适数量的功能线粒体是至关重要的。为提高体外成熟卵母细胞的线粒体功能，以提高卵母细胞和胚胎的发育能力，已提出IVM液的补充剂，大多基于沉默调节蛋白1(sirtuin1, SIRT1)功能的上调，可增加线粒体的活性[55]，很可能通过有丝分裂促进卵母细胞线粒体的生物合成和降解以及稳定线粒体膜电位。调节SIRT1功能的最常用的抗氧化剂之一是褪黑素，主要优点之一是它是由卵丘细胞自然分泌的，对人卵母细胞的研究[56]表明，褪黑素可通过降低过量的Ca2+浓度和维持线粒体膜电位来改善线粒体的功能。另一种用于补充IVM系统的抗氧化剂是白藜芦醇，植物性多酚化合物，有研究表明IVM培养液中添加1.0 μm白藜芦醇可改善纺锤体的形态和更正确的染色体定位[57]。另一种很有前途的线粒体靶向IVM培养的药物是抗氧化剂米托醌甲磺酸盐(mitoquinone mesylate,MitoQ)，可在没有任何载体的情况下被线粒体有效的摄取，在线粒体内部，MitoQ吸附在内膜上，对抗脂质过氧化[58]。虽然目前已有关于不同线粒体靶向补充剂对体外培养的有益效果，但还没有一种被引入临床实践。

此外，为了保持和体内相似的细胞形态和功能，提出了三维(three-dimensional, 3D)培养系统的概念，即在胶原蛋白、基质、纤维蛋白或其他生物材料(如3D支架)中培养细胞，这些材料可为细胞生长提供3D环境，模拟体内的生理条件，更好地保存了体细胞和卵母细胞之间的生理沟通，可能还可以更好地维持COCs的结构和通过缝隙连接进行沟通，并确保适当的功能活动[59]。为人类卵母细胞体外成熟的研究开辟了新视角，随着其进一步发展，被认为是提高人卵母细胞发育能力的一种很有前途的方法。

4 总结与展望

IVM技术是一项在IVF前就已建立的技术，近年来，CAPA-IVM双向IVM系统明显提高了IVM的成功率。此外，IVM技术与卵巢组织冻存移植的结合，可提高患者生育力保护的效率，而且对于卵巢携癌风险高的患者也是一个安全的选择。