三维微环境手性特征调控间充质干细胞线粒体功能

何 颖 冯传良 刘进营 郑慧敏 江圣杰*

(1. 北京大学口腔医院特诊科, 北京 100034; 2.上海交通大学材料科学与工程学院, 上海 200030;3.河南大学材料学院特种功能实验室, 郑州 450001)

骨充填生物材料被广泛运用在各类骨缺损修复，生物材料的多种物理性能，例如硬度、弹性、纳米拓扑形貌等，能够调节缺损区域的干细胞功能从而引导骨组织再生[1]。 手性是自然界广泛存在的一个基本物理特性[2]，前期已有研究[3]报道了手性能够调控间充质干细胞分化命运，同时对巨噬细胞的极化命运也有显著的调控作用[4]，而其调控的内在机制尚不明晰。

线粒体广泛存在于真核细胞内，其参与完成了多种细胞功能，包括三羧酸循环、能量转换、钙离子储存等，其生物功能的复杂性也使得其对于间充质干细胞成骨分化起着不可或缺的作用[5]。

本实验将通过细胞实验联合高通量分析和动物实验阐明手性三维微环境介导间充质干细胞线粒体功能调控细胞命运的机制。

1 材料与方法

1.1 三维干细胞培养方法

左旋右旋三维苯丙氨酸水凝胶由上海交通大学冯传良课题组制备。将凝胶因子粉末加入二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)溶液中，混合均匀至粉末完全溶解，制成凝胶因子DMSO 储备液。SD大鼠骨髓间充质干细胞(RASMX-01001)与SD大鼠骨髓间充质干细胞培养基(RAXMX-90011)购置于赛业生物科技有限公司，将手性储备液加入至细胞密度为 100万/mL的细胞悬液中，迅速用移液枪转移至 24 孔培养板内，每孔加入量为 500 μL。然后将 24 孔板转移至细胞孵育箱内，待凝胶形成，再加入培养基。根据细胞的生长情况，每2 d更换新鲜培养基。该实验于北京大学口腔医院完成。

1.2 免疫荧光染色

使用手性水凝胶对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)进行三维培养。在细胞接种后的第3天，使用直接法对手性基质中的 MSCs 进行线粒体的膜电位进行免疫荧光染色。染色时首先吸去 24 孔板内的培养基，用 PBS 溶液浸洗。然后分别加入使用PBS 配为1%(质量分数)BSA 溶液按相应比例稀释后的线粒体深红色荧光探针和线粒体绿色荧光探针染色。利用激光共聚焦显微镜对细胞进行观察、拍照。

1.3 大鼠颅骨缺损模型的建立及骨再生实验

为了验证左旋三维微环境中细胞相关蛋白表达，使用健康的5周龄SD大鼠建立颅骨缺损模型。首先用为 1%(质量分数)戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉大鼠。待麻醉后，术区备皮，切开，剥离骨膜，使用环钻在颅骨上打孔，使颅骨左右两侧分别形成对称的直径约5 mm的缺陷。将在手性水凝胶基质中培养 3 d的 MSCs(1 000万细胞/mL)注射到新形成的大鼠颅骨缺损中，然后用不可吸收膜覆盖以引导组织再生。每个缺损处总注射体积为100 μL。缝合。术后对大鼠使用青霉素以预防感染。在3 d后，通过吸入 CO2处死大鼠并手术分离颅骨样本。利用组织学检查来分析样品。

1.4 组织切片免疫组织化学法染色

40%(质量分数)甲醛对分离出来的颅骨标本固定，EDTA摇床脱钙14 d，包埋，切片，微波加热免疫组化抗原修复，缓冲液洗3 min，2次，在过氧化氢阻断剂(Abcam公司，美国，ab64218)中孵育 10 min使得免疫组化背景封闭，缓冲液洗5 min，2次，滴加非特异性背景染色处理剂，在室温下孵育 5 min以封闭非特异性的背景染色，缓冲液洗5 min，2次。CXCL2一抗(Abcam公司，美国，ab9777)孵育2 h，缓冲液洗5 min，2次，增强子室温孵育20 min，缓冲液洗5 min，2次，滴加酶标二抗，室温孵育30 min，缓冲液漂洗5 min，向1 mL过氧化氢缓冲液中滴加2滴3,3-二氨基联苯胺加强显色液体(DAB 底物试剂盒，ThermoScientific公司，美国，34065)，混匀后滴加到切片上，孵育15 min。自来水充分冲洗、复染、脱水、透明、封片。

1.5 高通量测序与统计学方法

RNA文库构建使用RNA文库制备试剂盒(Illumina©公司，美国)，按照厂家的标准流程进行，样本送至博奥晶典 (北京)公司进行测序，使用 NanoDrop 测定 RNA 浓度，凝胶电泳监测样本RNA的完整性，完成样本质检后利用 oligo-dT磁珠从总RNA分离具备poly-A 尾RNA，即mRNA。 mRNA经过片段纯化后，反转录合成 cDNA 第一链与第二链，并且对反转录产物末端修补为平末端，然后在3′末端加A。连接产物经过纯化，去除连接不完整的产物以及空的接头自连产物，运用与接头序列互补的通用引物对纯化样本进行PCR 扩增。扩增产物经过纯化去除引物二聚体、琼脂糖凝胶电泳质检以及浓度测定后，将浓度统一调整为 2 nmol/L，RNA文库构建即告完成后上机测序。利用通路可视化软件绘制京都基因和基因组数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)线粒体氧化代谢通路的可视化。对2 090个差异表达的基因进行富集分析，其中有146个差异基因注释到本文中的6个基因功能条目。相关结果图通过R软件进行绘制。利用超几何分布进行假设检验得到富集结果的P值，利用BH进行多重假设检验，校正P值，得到CorrectedP值，CorrectedP值越低富集结果越显著。利用Limma包进有生物学重复或配对的差异比较，差异基因筛选标准为：|log2FC|≥1且P值≤0.05。

2 结果

2.1 线粒体膜电位检测

在三维手性微环境中，间充质干细胞线粒体线粒体深红色荧光探针和线粒体绿色荧光探针双染标记分析结果显示左旋微环境中间充质干细胞线粒体线粒体深红色荧光与线粒体绿色荧光比例更高，并对左旋组和右旋组中20个细胞进行荧光比值定量分析，左旋组也显著高于右旋组，表明左旋微环境中间充质干细胞线粒体膜电位稳定，而在右旋组中线粒体深红色荧光与线粒体绿色荧光比例较低，右旋三维微环境中间充质干细胞线粒体膜电位功能受损(图1)。

图1 三维手性微环境中间充质干细胞线粒体膜电位染色Fig.1 Mitochondrial potential staining of mesenchymal stem cells in three-dimensional chiral microenvironment

2.2 组织学染色CXCL2趋化因子的表达

对大鼠颅骨缺损模型进行免疫组化切片染色，左旋水凝胶植入后在缺损区域促进间充质干细表达更多趋化因子CXCL2，而在右旋水凝胶植入后缺损区域CXCL2的表达明显更低(图2)。

2.3 KEGG线粒体膜功能可视化分析

通过对三维微环境中间充质干细胞线粒体膜氧化磷酸化功能KEGG信号通路可视化分析，对3 d样本进行转录组分析，发现多种线粒体表面膜蛋白发生了显著改变，特别是NADH相关酶活性Ndufa4出现显著改变，佐证了三维手性微环境改变会造成干细胞内线粒体膜功能的调整从而激活下游信号(图3)。

2.4 GO功能分析解析线粒体相关功能改变

通过对三维微环境中培养3 d的间充质干细胞转录组进行基因本体(gene ontology，GO)功能信号通路气泡图分析，发现多种线粒体功能发生了显著改变，包括线粒体组装、线粒体形态、线粒体降解、线粒体膜离子运输等(图4)。

图2 三维手性水凝胶结合间充质干细胞体内植入组化染色Fig.2 Histochemical staining of three-dimensional chiral hydrogel combined with mesenchymal stem cells in vivo

图3 KEGG线粒体氧化代谢通路可视化Fig.3 Visualization of KEGG mitochondrial oxidative metabolic pathway

图4 GO线粒体相关功能分析Fig.4 GO mitochondria related function analysis

2.5 线粒体降解功能相关基因表达

通过对三维微环境中培养3 d的间充质干细胞转录组中多个线粒体降解相关基因进行检测发现Ulk1、Stom、Map1、Vdec、Hlk2、Fundc2和Hsf2bp都出现了在右旋组表达上调，证明右旋微环境中间充质干细胞线粒体出现了降解(图5)。

图5 线粒体降解相关基因表达热图分析Fig.5 Heat map analysis of mitochondrial degradation related gene expression

3 讨论

在生物发生过程中建立协调的组织和器官是最基本的生物学过程之一，而干细胞异质性在其中起着至关重要的作用[6]。 作为支持胚胎主要结构的重要功能器官，人体骨组织来源于位于近轴/体周中胚层的干细胞[7]。此外，这些细胞还可以分化成其他谱系，包括脂肪细胞、真皮细胞和骨骼肌细胞[8]。了解干细胞命运的异质性发育机制对于产生这些重要结构和阐明先天性疾病的病因至关重要。

手性是指两个物质之间具备镜像的关系例如人的左右手，结构相似，但不能够完全叠合。手性如同硬度、弹性等是广泛存在于自然界的一个基本物理特性，大到天体的运动，小到蛋白质和DNA结构，都具备手性特征[9]。而在生物材料领域，如何赋予材料手性这一特征，优化生物材料物理性能，提高骨缺损区植入的再生效率，仍需更深的研究讨论。细胞行为与功能对细胞外环境的手性选择与规律不仅是生命起源的重大科学问题，也启发了再生医学支架材料活性功能设计。

线粒体对于干细胞分化尤为重要，现有研究[10]证明不同干细胞中线粒体丰度、形态和功能存在不同的变化，并且已经确定线粒体生物发生和氧化磷酸化的代谢转变是MSC分化的标志。除了在细胞能量代谢中发挥重要作用外，线粒体也是细胞信号传导的关键介质；骨髓间充质干细胞分化需要广泛的表观遗传重塑，包括通过甲基化、乙酰化和糖基化来调节转录的共价组蛋白或DNA修饰。研究[11]表明，细胞代谢的代谢中间产物需要作为表观遗传调节剂的辅因子，在线粒体代谢和基因表达之间提供直接联系。然而，对于细胞外基质如何调控干细胞线粒体功能从而调控干细胞分化的直接影响知之甚少，目前已有研究证明细胞能够识别细胞外基质信号，将环境信号传递到线粒体再继续呈递到下游[12]。

研究[13]显示右旋三维微环境中干细胞线粒体膜电位出现了早期损伤的表现，线粒体膜电位损伤是线粒体凋亡的早期表现，当干细胞线粒体功能出现障碍后，会影响干细胞分化功能。在动物实验中，本研究发现在左旋材料植入早期，缺损区域干细胞分泌更多的CXCL2因子，CXCL2是干细胞识别的趋化因子，其功能作用广泛，能够促进细胞的糖酵解活性和线粒体呼吸，由此看出在体内三维微环境中右旋微环境也不利于细胞的线粒体代谢途径。

通过高通量测序的深入分析，本研究发现左旋三维微环境能够显著上调线粒体NADH脱氢酶的表达，以往研究[14-15]报道线粒体NADH脱氢酶活性抑制会造成线粒体功能损伤，这也与本研究结果相吻合。本研究中右旋微环境中NADH脱氢酶活性降低，表明右旋微环境中干细胞线粒体功能在早期已经出现障碍。本研究又对相关信号通路进行分析，结果发现手性微环境不同线粒体组装、线粒体形态、线粒体降解、线粒体膜蛋白定位，线粒体膜钙离子运输，线粒体轴突转运等功能也会出现差异，证明了手性微环境对细胞线粒体功能调控显著。同时，在右旋微环境中线粒体降解相关基因表达上调，表明线粒体在右旋微环境中开始凋亡。

本研究的前期研究[3-4]发现，左旋微环境利于干细胞成骨分化，在本研究中找到了三维手性微环境调控干细胞命运的关键途径，左旋微环境中干细胞的线粒体NADH脱氢酶表达上调，线粒体代谢功能增强，帮助了间充质干细胞向成骨方向分化，而右旋微环境中干细胞的线粒体降解凋亡增多，线粒体膜电位受损，不利于间充质干细胞的成骨方向分化。综上所述，手性三维微环境可以调节植入干细胞的线粒体功能从而参与干细胞的分化命运，其中左旋微环境通过对细胞线粒体相关基因的调控，有利于间充质干细胞的成骨分化，对成骨有促进作用，在治疗骨缺损方面具有潜在的应用价值，可以为临床研究和应用提供依据和参考。