黄芪甲苷抗肾纤维化的相关分子机制研究

卢海霞，覃柞莲，陆丽娟，吴炳瑶，谢 丽，李 丽

广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530001

现代医学研究表明，肾纤维化主要与成纤维细胞的活化和增殖、炎性细胞的浸润及细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的积聚密切相关，因此，积极开发阻断炎症、抑制细胞凋亡、减轻间质ECM 的过度沉积、提高免疫力的药物显得弥足重要［1-5］。目前，抗肾纤维化的西医常规药物包括免疫抑制剂、激素、血管紧张素转化酶抑制剂（angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI）/血管紧张素受体阻滞剂（angiotensin receptor blocker，ARB）类等药物，但这些药物在抗肾纤维的进程方面没有显示出抑制肾脏纤维化的优势。因此，愈来愈多的学者开始从中医药宝库中的中药单体、中药复方中寻求治疗措施，以弥补现阶段肾病常规药物治疗所面对的窘迫处境。国内外研究［6-8］已证实黄芪对保护肾脏、治疗慢性肾脏疾病有显著效果，具体机制主要为保护肾小管细胞、抑制肾纤维化、保护足细胞等方面，其中黄芪甲苷（astragaloside IV，AS-IV）是黄芪中含量最高、活性最为广泛及占主导地位的有效成分之一。故现代医学中AS-IV 也被广大医者运用于慢性肾脏疾病的治疗中。其中，诸多研究证实AS-IV 具有抑制纤维化［9-12］、抗炎［13-14］、抗凋亡［15-18］等作用，因此在抗肾纤维化领域具有显著成效，具有广泛的应用前景。故本文通过综述AS-IV 抗肾纤维化的分子机制，为该药进一步临床研究及接下来开发利用提供参考依据。

1 肾纤维化的病因

肾纤维化主要特征为肾组织的破坏及肾功能由健康到逐渐丧失的渐进过程，主要机制为肾脏由于创伤、感染、免疫反应等一系列致病因素，如药物中毒、糖尿病、高血压、感冒等刺激，致使ECM产生的重要效应器成纤维细胞被过度激活，以ECM 不断产生和积累为特点，因此，成纤维细胞的过度激活被视为肾纤维化发病机制的一个关键拮抗因素［18-19］。

2 肾纤维化的病理生理机制

原发性和继发性的肾脏病理刺激损伤均可引起肾脏组织内微循环代谢障碍，致使肾组织缺血和缺氧，使肾脏毛细血管内皮细胞受损，从而诱导炎性细胞浸润且释放类似白细胞介素1（interleukin-1，IL-1）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等炎性介质，并逐渐积累可渐进性导致肾脏发生纤维化改变。肾脏组织纤维化后可释放结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）、转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）、内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等生长因子和许多毒性细胞因子。后者可导致表型转化，甚则分泌及合成一系列ECM 类介质，如胶原纤维蛋白I 型与Ⅲ型。由于它们不易被降解的特质，致使ECM 不断被生成并大量积累，导致发生肾小球硬化、肾间质及血管纤维化或进程加剧。肾纤维化渐行性的不断发展，最终发展成为瘢痕组织，同时伴随肾功能的逐步减退，最终形成终末期肾脏病（end-stage renal disease，ESRD）［20］。目前国内外研究探讨与肾纤维化关系最为密切的病理生理机制如下。

2.1 TGF-βTGF-β是慢性肾脏病中的一种由许多肾细胞合成可启动并调节一系列病理生理过程的促纤维化细胞因子。在肾脏疾病中，TGF-β通常可通过有丝分裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）及Smad 等信号通道显著上调，以促使肾组织细胞过度产生ECM蛋白，从而导致肾小管间质纤维化。不同类型的肾细胞诱导后，经过一系列的病理生理变化，通常最终致使细胞肥大，甚至凋亡及足细胞的足突异常，从而导致肾功能不全［21］。肾纤维化是ECM过度产生与积聚到一定程度后最为常见的结果，常发生于糖尿病性肾病和膜性肾病。TGF-β被认为是调控肾小管上皮间充质转分化（epithelialmesenchymal transition，EMT）的重要调节因子。除了参与调控ECM 蛋白合成及肾细胞凋亡、肥大和增殖外，还参与蛋白激酶和转录因子等多种细胞内信号转导途径［22］。TGF-β家族成员之一TGFβ1刺激肾小管上皮细胞促进ECM 的主要来源之一α-平滑肌肌动蛋白α-SMA的表达。而TGF-β1被阻断后，α-SMA 表达减少，表明TGF-β1能够促进ECM过度产生及积累，致使细胞外基质形成，最终促进肾小球发生纤维化［23-26］。

2.2 ECM肾间质纤维化通常由生长因子、血管生成因子、纤维细胞因子和蛋白酶等分子致使发生慢性炎症，进而刺激ECM 成分过度产生与超负荷积累，从而导致发生肾纤维化。其中与生长因子β1（growth factor-β，GF-β1）关系密切。GF-β1诱导肾间质纤维化的具体机制为GF-β1通过启动EMT通过信号通路（Smad 为主），致使活化的肌成纤维细胞与ECM 的过度产生，同时抑制ECM 降解，使其逐渐堆积［27-28］。

2.3 EMTEMT 在进展性肾纤维化发生及发展过程中占有举足轻重的作用［29］。在进展性肾纤维化过程中，不完全再生的肾小管上皮细胞中未成熟的间充质表型代替了原本上皮细胞表型，并逐渐转化为肾纤维化主要病因之一的纤维细胞及肌成纤维细胞（myofibroblast，MFB）。MFB 过量合成大量ECM 并堆积，加快肾脏纤维化病变的进展［30］。血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）上调TGF-β的表达，最终结果可导致小管上皮细胞发生成纤维细胞活化和EMT［31］。

2.4 其他国内外研究表明肾脏间质成纤维细胞、肾小管上皮细胞、巨噬细胞等，细胞因子如IL-6、血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）、骨形成蛋白7（bone morphogenetic protein 7，BMP-7）、白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）、AngⅡ表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、TNF-α、白细胞介素3（interleukin-3，IL-3）等细胞间质均与肾纤维化关系密切［32-33］。

3 抑制肾脏纤维化

无论是复发性还是续发性蛋白尿的原发性或续发性的慢性肾病发病过程，肾小管萎缩和肾小管间质纤维化都在此病发病过程中起关键作用［34-36］。因此，无论是哪种性质的蛋白尿均可看做肾小球疾病严重程度和肾小球及肾小管间质更进一步损伤的主要因素。同时，大量的蛋白尿浸润，在蛋白超负荷的环境下，致使近端小管的上皮细胞凋亡及诱导肾间质炎症反应相关因子施放与补体激活，如细胞因子、趋化因子和血管活性分子。管状细胞最终分化为肌成纤维细胞，加重原有肾间质纤维化进程，肾功能渐行性恶化［37-38］。

3.1 抑制MAPK/核转录因子κB(nuclear factorκB，NF-κB)信号通路慢性炎症反应引起的成纤维细胞增生及肾脏组织被刺激后致使ECM 的过度产生和超负荷积聚与肾间质纤维化的发生及进展密切相关。ECM是由纤连蛋白、胶原蛋白、层黏连蛋白等纤维蛋白和蛋白多糖组成的动态结构。国内外相关研究证实TGF-β可在抗肾间质纤维化的过程中发挥重要作用，具体机制为TGF-β信号途径转导至Smad 途径及非经典途径后，通过激活P38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen activated protein kinase，p38MAPK）等APK 家族信号通路抑制基质降解及上调基质蛋白合成［39-42］。此外，国外研究表明AS-IV主要以剂量依赖性方式抑制大鼠肾成纤维细胞的分化，机制可能与AS-IV可下调细胞增殖标志物增殖细胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen，PCNA）的表达及抑制TGF-β1诱导的α平滑肌肌动蛋白（α smooth muscle actin，α-SMA）增多，进而加强抑制TGF-β1诱导的大鼠肾成纤维细胞活性及效能的作用，同时，研究证实AS-IV可降低TGF-β1活性，进而抑制肾纤维化密切相关的肾成纤维细胞中ERK1/2、p38MAPK和JNK 的活化程度及抑制TGF-β1诱导NF-κB p65亚基的核转位［37，43］。IκBα是IκB家族中NF-κB的上游关键分子的主要家族成员，而NF-κB p65对调控靶基因转录及NF-κB 占有举足轻重的地位［36，44-45］。以上研究表明，AS-IV 可通过调控MAPK、NF-κB 及p38MAPK 信号通路途径阻滞ECM 过度生成及堆积和肾成纤维细胞分化及胶原蛋白、纤连蛋白、α-SMA 合成等方式在抗肾纤维化领域发挥显著作用［19-20］。

3.2 抑制TGF-β/Smad 信号通路TGF-β受体是活化后可通过Smad 依赖性和非Smad 依赖性传递信号的丝氨酸/苏氨酸激酶跨膜异型受体复合物［46-47］。其中，肾脏的纤维化与Smad 信号传导途径中的Smad2/3 等分子明显升高关系密切［48］。TGF-β/Smad 信号通路被激活后，使肾纤维化过程中细胞外基质的主要来源之一肾小管上皮细胞EMT 产生过程的间充质细胞标记物α-SMA 蛋白表达增加［49-50］，因此，其浓度水平可一定程度反映肾纤维化发展的程度。此外，大量研究［22，49］已证实AS-IV 可 通 过 降低DN 小 鼠肾 组织 中TGF-β1、Smad2/3 和α-SMA 蛋白表达抑制TGF-β/Smad 信号通路，最终抑制肾脏纤维化和肾小管上皮细胞EMT。

3.3 抑制TLR4/NF-κB 途径当肾脏受到不可忽视的破坏时，包括成纤维细胞、内皮细胞、足细胞及肾小管上皮细胞等肾脏细胞几乎都会参与ECM的生成与肾脏修复的过程，同时，炎症细胞包括淋巴细胞、单核/巨噬细胞等细胞均通过不同途径参与肾纤维化的异常修复，表现为成纤维细胞增殖、炎症细胞浸润及ECM积累，其中NF-κB是调控促炎介质产生，促使这一系列炎症反应发生及可用于确定炎症反应的关键转录因子［51］。国外研究显示AS-IV 能高效能抑制可诱导炎症反应的前馈关键因子，如IL-1β、促炎介质TNF-α的活性，致使浸润性巨噬细胞和淋巴细胞数量、炎症细胞因子IL-1βmRNA及TNF-α水平相应减少［52］，以降低单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）肾纤维化模型小鼠纤连蛋白和胶原蛋白I 含量，从而遏制炎性细胞浸润和炎症细胞因子分泌。国外体外研究表明AS-IV 可抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激的人肾小管近段上皮细胞中TNF-α和IL-1βmRNA 水平［53］。TLR 家族主要成员之一TLR4（TLR是LPS的受体之一），它可通过诱导炎性细胞因子表达及激活NF-κB 致使炎症反应发生及发展［54］。此外，相关研究通过小鼠实验，明确表明AS-IV 抑制剂IκBβ表达抑制了UUO小鼠TLR4 受体及NF-κB 表达，上调NF-κB，与TLR4抑制剂TAK-242 高度相似［52-53］。相关实验研究表明，AS-IV 可通过抑制TLR4/NF-κB 信号通路减弱肾脏炎症反应［55］。综上所述，AS-IV 可通过TLR4/NF-κB 途径减少肾纤维化发生或发展中伴随的炎症反应，达到延缓甚至改善肾纤维化进展的目的。

4 含黄芪的抗肾间质纤维化的中药制剂及中成药

4.1 肾康注射液肾康注射液是一种临床上常见且有效成分主要由黄芪、大黄、丹参、红花中提取与精制而成的中药注射剂，现代医学主要用于治疗慢性肾衰、糖尿病肾病及肾病综合征等肾脏领域疾病。相关研究［56-58］表明SKI具有抗纤维化、抑制TGF-β1、骨形成蛋白7（bone morphogenetic protein-7，BMP-7）及抗炎的作用，在降低患者血清中肌酐和尿素氮水平、延迟肾小球硬化、提高肾小球滤过率、抑制肾间质纤维化及提高肾血流量等肾脏疾病病因方面也具有显著成效。

4.2 黄芪当归合剂黄芪当归合剂是一种由黄芪和当归组成的中成药，LI S 等［59］研究表明，黄芪当归合剂能够通过降低CKD 病患的血肌酐和尿素氮、提高肾小球滤过率，最终达到改善肾脏功能的目的。黄芪当归合剂还具备抑制5/6Nx 大鼠细胞外基质的聚集、纤连蛋白（fibronectin，FN）、肾小球硬化及胶原IV（Col-IV）表达的作用，进而阻滞肾纤维化发生及发展［60］。

4.3 尿毒清颗粒尿毒清颗粒是以黄芪为主要成分用于慢性肾脏病变领域的常用中成药物，具有抗凝、促纤溶、免疫调节的功效［61-62］，文丰等［63］通过临床对照实验发现常规西医治疗辅助尿毒清颗粒可通过改善钙磷代谢及肾功能指标延缓肾纤维进程；谭菲等［64］构建糖尿病肾病SD 大鼠模型实验，表明尿毒清颗粒能够通过调控TGF-β1/p38MAPK，改善大鼠肾功能和减轻肾脏组织的病理损伤，具体为下调TGF-β1、p38MAPK、Caspase-3 mRNA，抑制TGF-β1/p38MAPK信号转导通路等一系列内容。

4.4 肾康丸杨爱成等［65］研究表明肾康丸通过可下调DN 大鼠肾脏组织下调DN 大鼠肾脏组织中TRAIL 系统的主要的调节因子NF-κB mRNA，蛋白表达NF-κB mRNA 及蛋白表达，对大鼠的肾功能具备一定保护作用，可延缓肾纤维的进展。此外，相关研究表明，肾康丸可通过阻断Smad2/3 信号致使End MT 进程受阻的方式最终达到抑制End MT 促肾脏纤维化的进程［66］。

4.5 黄芪三七合剂邓小芳［67］通过构建慢性肾脏疾病（chronic kidney disease，CKD）大鼠模型，认为黄芪三七合剂可延缓慢性肾纤维的进程，其中与减弱p38MAPK 蛋白表达密切相关，由此对大鼠肾脏具有保护作用。王露等［68］的研究表明黄芪三七合剂具备降低CKD 大鼠肌酐(serum creatinine，SCr)、尿 素氮(blood urea nitrogen，BUN)的作用，降低肾组织α-SMA、TGF-β1蛋白的表达，以恢复CKD 大鼠肾功能并延缓其肾纤维化进程。

4.6 黄芪丹参颗粒付旭等［69］通过大鼠研究证实黄芪丹参颗粒可在一定程度上改善大鼠的肾功能及保护肾脏组织，作用机制可能与黄芪丹参颗粒可有效降低Wnt4和β-catenin在肾组织中的表达，进而影响肾间质纤维化过程中肾小管上皮细胞转分化以干预Wnt/β-catenin 信号通路，最终达到保护UUO 大鼠肾小管功能的目的，且存在一定量效关系。

5 结语与展望

肾纤维化病理生理机制主要为肾脏胶原蛋白合成增加、降解减少，EC大量积累［70-72］。过往研究表明，由于肾纤维化发病机制过于复杂，病势缠绵难愈，病久必虚，病久必瘀，甚至部分患者不可避免地发展成为ESRD。黄芪甲苷在慢性肾脏疾病的治疗中，尤其在抗肾纤维化进展中得到广泛应用。因此，更多的分子机制将有待研究证实。明确黄芪甲苷抗肾纤维化产生及发展的相关靶标和途径能够为其在肾脏系统或其他系统疾病中的运用提供依据。另外，已有研究证实AS-IV 主要通过剂量依赖等方式阻止及防范足细胞凋亡及抑制肾脏纤维化［73-75］，因此需要学者从AS-IV其剂量和安全性问题方面作进一步探索研究。

以此为索引，深入了解肾纤维化的发生发展机制，大量基础实验显示单一靶点很难发挥疗效［76-80］，因此需从多方位、多环节、多靶点新型中药复方药物着手进行研究。研究肾纤维化，把中医和西医病因病机以及治疗融会贯通，辨病和辨证有机结合，找到逆转或减弱肾纤维化的科学方法指日可待。