湖南某猪场发病母猪病原菌的分离鉴定及耐药性研究

李彦超，张 军，黄金虎

（1.法国诗华动物保健公司，北京 朝阳 100102；2.南京农业大学兽医学院，江苏 南京 210095）

猪链球菌（Streptococcus suis）是有荚膜包裹的革兰氏阳性球菌。猪链球菌天然定植在猪的上呼吸道，尤其是扁桃体和鼻腔，以及猪的生殖器和消化道。在各个年龄段的猪群中都很容易检测到，当猪群中存在容易导致免疫力降低，或对猪链球菌入侵的导致抵抗力降低的易感因素时，猪链球菌都可能导致猪群发病。

湖南猪场存栏基础母猪5 000头，母猪群选用蓝耳病弱毒苗和灭活苗免疫方案。2021年11月，该场出现怀孕母猪后肢无力，瘫痪，耳朵发绀（图1），体温高达40.5 ℃，食欲不振等现象。6月份该场曾发生过由于水质较差而引发的母猪血痢，同时伴有少量流产。10月份发生怀孕后期流产，产出部分自溶胎和白胎。发病母猪剖检脾脏边缘出血（图2），肝脏出血（图3），胆囊萎缩且胆汁很少，肺小叶尖叶有出血灶（图4），淋巴结肿大等。猪场内部实验室检测显示伪狂犬病野毒阴性。

图1 母猪瘫痪，耳朵发绀

图2 脾脏边缘出血

图3 肝脏出血

图4 肺脏有出血灶

为了确定感染的病原菌，该猪场负责人采集了患病猪的血液、胎衣、肝脏、脾脏、淋巴结等样品，送至南京农业大学兽医药理与毒理课题组进行细菌分离鉴定以及抗生素的药敏试验，旨在为猪场的疾病防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 病料收集信息

采集了病猪的9份病变器官样品，见表1。由于猪场进行成本控制，近期未添加药物。

表1 样品信息

1.2 病原菌分离培养和纯化鉴定

病原菌的分离纯化和药敏试验按照如下流程（表2）进行。

表2 试验流程

取病猪各病料组织（图5），用酒精棉球点燃消毒病料表面，无菌手术刀切口，接着用经火焰灭菌并冷却的接种环蘸取病料内部组织后，同时无菌划线接种于培养基，37 ℃恒温培养24 h。

图5 病料组织

观察菌落，如菌落生长缓慢，可延长至48 h，使之形成单菌落（图6），以供鉴定用。挑取疑似菌落纯化后进行16S测序确定菌种。

图6 初步分离菌落

1.3 药敏试验（MIC测定）

根据美国临床检验标准委员会（CLSI）推荐的微量稀释方法测定各种抗菌药物对猪链球菌的MIC。将培养好的菌液用MH培养基调至0.5个麦氏浊度单位进行测定。细菌培养物放入37 ℃恒温培养箱24 h后观察并记录结果（图7）。

图7 微量肉汤稀释法药敏试验

2 结果与分析

2.1 疑似菌株测序

样品在平板上培养，选取形态不同疑似菌落纯化后进行16S测序，测序结果序列上传至NCBI 16S rRNA数据库进行BLAST比对。结果如表3所示：检测到的菌株主要有猪链球菌（脾脏、肺脏、淋巴结）、绿色魏斯氏菌（肺脏、脾脏）和布氏不动杆菌（脑）。最可能的致病菌为猪链球菌。

表3 16S测序结果

2.2 猪链球菌药敏试验MIC结果

在9份器官样品中，有3份样品分离纯化得到猪链球菌（表4）。

表4 猪链球菌分离菌株

分析肺脏和脾脏组织的链球菌最可能是致病菌（淋巴结部位可能是常在菌），选择该两株分离菌，参照CLSI和EUCAST方法测定了20种抗菌药的MIC并依据猪链球菌的折点进行分析（表5）。结果显示，两株猪链球菌对氟苯尼考、阿奇霉素、林可霉素、克林霉素、泰妙菌素、替米考星、泰拉菌素高度耐药。对阿莫西林、头孢菌素、环丙沙星、四环素等敏感。

表5 猪链球菌药敏试验MIC结果 mg/L

根据药敏试验结果，建议该猪场采取以下方案：母猪群使用10%阿莫西林粉（1 500～2 000 g/t料）或者10%盐酸多西环素（1 000～1 500 g/t料）进行全群保健，对于患病母猪采用头孢噻呋钠（3～5 mg/kg体重，重症加倍）或者10%恩诺沙星注射液（2.5 mg/kg体重）肌注治疗；产房仔猪（鉴于母猪感染严重）在剪牙、断尾时使用15%长效阿莫西林注射液（15 mg/kg体重）进行保健；仔猪断奶当天或者前、后一天，使用15%长效阿莫西林注射液（15 mg/kg体重）进行保健后转保。猪场反馈该方案执行后效果理想，很快控制了疾病，降低猪场的损失。

3 讨论

猪链球菌可在初生仔猪早期的上呼吸道定植，如果没有应激或蓝耳病等感染问题，一般不发病。发病时间集中在产房阶段和断奶后的保育时期，临床表现以脑膜炎、关节炎为主，败血和心膜炎相对少些。中大猪偶有发生。成年母猪由于自身抵抗力较强，加上猪场进行常规母猪群体预防性保健，因此较少出现典型的猪链球菌临床症状。该猪场由于前期饮水污染导致猪群受到影响，加上猪价低迷而停用药物保健，引起母猪群体发病，给猪场带来较大的损失。

猪链球菌是极难通过疫苗控制的细菌性疾病之一，防控主要以抗生素预防和治疗为主。但是由于猪场的不规范用药，极易使链球菌产生耐药性。本试验的分离菌株，通过耐药性鉴定，对大环内酯类、截短侧耳素类、醇酰胺类等常用抗生素显示出很高的耐药性。药敏检测与国内一些研究结果类似：蔡田等（2019）从河南等7省份573份病料分离出的165株猪链球菌，显示出对大环内酯类抗生素耐药率高达98.1%，且测定的与耐药性有关的靶位修饰和主动外排基因，均为获得性耐药基因，可在细菌之间传播[1]。王治方等（2020）报道对分离的68株猪链球菌，除对头孢噻呋、头孢他啶、阿莫西林和氨苄西林敏感外，对其他诸如大环内酯类、喹诺酮类、四环素类等均高度耐药，且存在多重耐药的情况[2]。

青霉素和阿莫西林在大多数国家被用作猪链球菌的预防性治疗。使用阿莫西林可以使药物迅速在胞质中达到高水平，并很好的扩散到细胞外。使用头孢噻呋治疗可以显著降低死亡率、降低肺部损伤的严重程度，以及减少尸检时从组织中分离的猪链球菌[3]。因此，阿莫西林和头孢菌素类是临床预防和治疗猪链球菌最常用的药物。

头孢菌素作为临床优秀的抗菌药物之一，近年来在养猪生产中被大量应用。但是细菌繁殖过程中会产生β-内酰胺酶（包括青霉素酶和头孢菌素酶等），极易使头孢菌素产生耐药性[4]。史开志等（2020）报道，2013—2019年从贵州省7个地区，分离的517株副猪嗜血杆菌对头孢噻呋的耐药率升高324.68%[5]。李崇等（2019）报道，从广西某区域采集的猪源病料中，分离得到65株猪源大肠杆菌，其中对头孢噻呋钠的耐药率达到87.69%[6]。由此可见，实际生产中由于不正确使用头孢菌素带来的危害很大。2019年欧洲药品管理局将头孢噻呋列为B类（restrict，“限制”），具有较高的耐药性风险，建议限制使用[7]。2021年中国兽药协会发布《抗菌药物视频动物临床应用分级管理目录》将头孢噻呋列为限制性使用种类，应适当限制头孢菌素在养猪生产中的大面积预防保健使用。

4 结论

本研究对湖南永州某猪场发病猪进行病料组织采集，经过实验室细菌分离鉴定为猪链球菌。药敏试验结果显示，分离出的2株链球菌对阿莫西林、头孢菌素、环丙沙星、四环素等敏感，对大环内酯类、截短侧耳素类、醇酰胺类等常用抗生素显示出高度耐药性。建议临床上防控猪链球菌将阿莫西林作为首选预防保健性用药，对于个体治疗可以根据药敏试验结果选择敏感抗菌药物。