基于化学计量学结合UPLC评价白术药材质量

林 爽，王 杰，高珊珊，张志强，周永康，吉艳慧

（1. 北京康仁堂药业有限公司，北京 101301；2. 中药配方颗粒关键技术国家地方联合工程研究中心，北京 101301）

白术在我国具有悠久的应用和栽培历史，主要生长分布于浙江、江西、安徽、河南等地[1]，其主要成分为挥发油[2-3]、多糖[4-6]、内酯类[7-9]等，药理学研究表明具有保肝、调节胃肠运动、抗炎性反应、调节免疫系统、降血糖等作用[10-11]。白术作为我国的大宗药材品种，在临床上亦有广泛应用。

在白术药材的质量控制方面，有指纹图谱研究[12-15]报道，提示白术质量与产地、不同炮制规格存在一定的相关性。含量测定方面多集中在内酯类[16-18]的成分，也有少部分有机酸类[19-20]成分研究，未见同时检测两大类成分含量的文献报道。本次试验采用超高效液相色谱法建立指纹图谱，结合化学计量学，分析研究影响白术质量的主要成分群，筛选出影响白术质量的两大类关键性成分，并对其中5种化合物定量分析，为白术的质量评价提供参考。

1 材料

1.1 仪器

ACQUITY UPLC H-Class型超高效液相色谱仪（搭载PDA检测器，配备Empower3工作站）、CORTECS UPLC Shield RP18色谱柱（2.1 mm×150 mm，1.6μm）（美国Waters公司）；ML204T型分析天平 （d = 0.001 g）、MSA6.6S.0CE-DM型电子天平（d = 0.001mg）（德国Sartorius公司）。

1.2 试药

乙腈（色谱纯，德国Merck KGaA公司）；磷酸（色谱纯，美国Fisher公司）；蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）；甲醇（分析纯，国药集团有限公司）。

绿原酸（批号：110753-202119，纯度：96.3%）、3, 5-O-二咖啡酰基奎宁酸（批号：111782-201807，纯度：94.3%）、4, 5-O-二咖啡酰基奎宁酸（批号：111894-202104，纯度：95.1%）、白术内酯Ⅲ（批号为111978-201501，纯度：99.9%）、白术内酯Ⅱ（批号：111976-201501，纯度：99.9%）以上5种对照品购于中国食品药品检定研究院；新绿原酸（批号：DSTDX001502，纯度：99.68%）、隐绿原酸（批号：DSTDY003502，纯度：98.77%）以上2种对照品购于成都德思特生物技术有限公司。

1.3 药材

收集的16批白术样品为北京康仁堂定点采购的菊科植物白术Atractylodis macrocephalaeKoidz一年至两年生的干燥根茎，经北京康仁堂药业有限公司“中药传承工作室”工程师于立伟鉴定为正品白术。其中，S1 ～ S6产地为安徽、S7 ～ S12产地为河南、S13 ～ S16产地为浙江，样品信息见表1。

表1 白术样品信息表Tab. 1 Sample information table of AMR

2 方法与结果

2.1 指纹图谱研究

2.1.1 色谱条件 色谱柱为CORTECS UPLC Shield RP18（2.1 mm×150 mm，1.6μm），流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱顺序为0 ～ 8 min，8% → 12%A；8 ～ 18 min，12% → 39%A；18 ～ 30 min，39% → 48%A；30 ～ 40 min，48% → 90%A。体积流量为0.3 mL/min，柱温为30℃，检测波长为221 nm，采样体积为3μL。

2.1.2 配制参照物对照品溶液 以50%甲醇为溶媒制成每1 mL含10µg的白术内酯Ⅲ溶液。

2.1.3 配制样品溶液 精密称取白术粉末1 g，于100 mL具塞锥形瓶中，精密加50%甲醇25 mL，密塞，称重，80℃加热回流提取30 min，冷却后补足失重，离心，过滤。

2.1.4 精密度试验 按“2.1.3”项配制白术样品（S1）溶液后，按“2.1.1”项连续进样检测6次，参考峰设定为白术内酯Ⅲ，并计算出21个共有峰与参考峰的相对保留时间和相对峰面积，RSD分别为0.01% ～ 0.04%、0.17% ～ 2.56%，表明仪器具有良好的精密度。

2.1.5 稳定性试验 按“2.1.3”项配制白术样品（S1）溶液后，按“2.1.1”项下分别在0、2、4、8、12、24 h进样检测，参考峰设定为白术内酯Ⅲ，并计算出21个共有峰与参考峰的相对保留时间和相对峰面积，RSD分别为0.01% ～ 0.06%、0.17% ～ 1.98%，表明在24 h内样品溶液具有良好的稳定性。

2.1.6 重复性试验 按“2.1.3”项配制6份白术样品（S1）溶液后，按“2.1.1”项进样检测，参考峰设定为白术内酯Ⅲ，并计算出21个共有峰与参考峰的相对保留时间和相对峰面积，RSD分别为0.01% ～0.08%、0.17% ～ 2.89%，表明该方法具有良好的重复性。

2.1.7 多批次样品色谱图 按“2.1.3”项配制16批白术样品溶液后，按“2.1.1”项进样检测，将色谱图导入“指纹图谱相似度评价系统（2012版）”，设置S1为参照图谱、时间窗宽度为0.1，采用中位数法结合全谱峰匹配方式，得到16批白术指纹图谱叠加图及对照指纹图谱，见图1，其相似度在0.972 ～0.995，表明各批次之间相似度良好。

图1 16批白术药材的UPLC叠加图谱（S1 ～ S16）及对照图谱（R）Fig. 1 UPLC fingerprints of 16 batches of AMR（S1 ～ S16）and reference fingerprints（R）

2.1.8 共有峰的指认 经匹配后标定了16批白术中的21个共有峰，通过对照品比对，指认出7个色谱峰，分别为新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸、4, 5-O-二咖啡酰基奎宁酸、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ，见图2。9号色谱峰（白术内酯Ⅲ）保留时间和峰面积适中，故以峰9为参照峰。

图2 7个共有峰在白术中的指认Fig. 2 Identification of seven common peaks in AMR referenc

2.2 化学计量学分析

2.2.1 聚类分析（CA） 以16批白术指纹图谱21个共有峰的峰面积为变量，应用SPSS 25.0软件进行CA分析，聚类方法为组间联接，应用平方欧式距离、标准化采用Z得分方法，聚类分析结果见图3，当类间距为15 ～ 20时，16批白术药材可以被分为3类，分别为S7 ～ S12、S13 ～ S16、S1 ～ S6，这三类白术样品的产地分别为安徽、河南和浙江，提示白术的质量与产地具有一定的相关性。

图 3 16批白术药材聚类分析树状图Fig. 3 Cluster analysis of 16 batches of AMR

2.2.2 主成分分析（PCA） 以16批白术指纹图谱21个共有峰的峰面积为变量，应用SPSS 25.0软件进PCA分析，特征值和方差贡献率结果见表2。提取出主成分特征值大于1的共有5个，累积贡献率为88.32%，大于50%，能够表征16批白术的质量特点。初始因子载荷矩阵结果见表3，其中，第1主成分包含的信息量最大，峰9、峰12、峰11（均大于0.9）有明显的载荷值；峰14、峰20、峰15（均大于0.8）在第2主成分中有明显的载荷值；峰7、峰5、峰6（均大于0.85）在第3主成分中有明显的载荷值，表明影响白术药材质量差异性的是多个成分。鉴于主成分1的贡献值最大，因此筛选峰9（白术内酯Ⅲ）、峰12（白术内酯Ⅱ）作为含量测定的指标性成分。用SIMCA 14.1绘图软件，对21个共有峰的峰面积进行主成分分析，结果见图4，其结果与聚类分析结果一致。

图4 白术PCA 图Fig. 4 PCA plots of 16 batches of AMR

表2 特征值与方差贡献率Tab. 2 Eigenvalue and contribution rate

表 3 初始因子载荷矩阵Tab. 3 Initial factors loading matrix

2.2.3 偏最小二乘法判别分析（PLS-DA） 以16批白术的共有峰的峰面积为变量，使用SIMCA 14.1软件进行PLS-DA分析。建立的PLS-DA模型中，累积解释能力参数R2X和R2Y分别为0.659和0.841，预测能力参数Q2为0.774，均大于0.5，说明模型可靠。由PLS-DA得分图（图5）可知，16批白术样品被分为3类，根据模型中变量权重要性排序（VIP）预测值（见图6），筛选出具有统计学意义（VIP＞1）的差异标志物，分别为峰13（VIP = 1.32）、峰4（VIP =1.27）、峰3 （VIP = 1.25）、峰1（VIP = 1.23）、峰8 （VIP =1.22）、峰2（VIP = 1.21）、峰16（VIP = 1.01）。因此，筛选峰4（绿原酸）、峰3（隐绿原酸）、峰2（新绿原酸）可作为鉴别和区分白术质量的标志物，选择为含量测定指标成分。

图 5 白术的 PLS-DA 得分图Fig. 5 PLS-DA scores plots of 16 batches of AMR

图6 VIP 值Fig. 6 VIP plot

2.3 含量测定

2.3.1 检测波长的选择 在白术指纹图谱中，新绿原酸、隐绿原酸和绿原酸3种有机酸类的响应值和分离度不佳，不能达到含量测定的检测要求，因此选择其它检测波长。提取三者的PDA光谱图，发现均在324 nm左右处有最大吸收，且基线平稳，分离度大于1.5，因此选择324 nm检测有机酸类成分。提取白术内酯Ⅲ和白术内酯Ⅱ的PDA光谱图，发现在紫外吸收末端处有最大吸收，因此选择221 nm检测内酯类成分。混合对照品和样品在324 nm和221 nm波长下的色谱图见图7。

图7 混合对照品溶液（A、C）和供试品溶液（B、D）的UPLC色谱图Fig. 7 UPLC chromatograms of mixed control（A/C）and sample（B/D）

2.3.2 色谱条件 在324 nm测定新绿原酸、隐绿原酸和绿原酸；在221 nm测定白术内酯Ⅲ和白术内酯Ⅱ，余同“2.1.1”项指纹图谱色谱条件。

2.3.3 配制对照品溶液 以50%甲醇为溶媒制成每1 mL含3、6、10、10、8µg的新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、白术内酯Ⅲ和白术内酯Ⅱ的溶液。

2.3.4 配制样品溶液 同“2.1.3”项样品溶液配制方法。

2.3.5 线性关系考察 以50%甲醇为溶媒配制成每1 mL含14.562、2.602、30.153、32.012、25.392μg的新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、白术内酯Ⅲ和白术内酯Ⅱ的储备液。精密量取储备液15.0、10.0、5.0和1.0 mL，分别置20 mL容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，得系列浓度培养液后，按“2.3.2”项进样测定，以峰面积为纵坐标（Y），对照品浓度为横坐标（X，µg/mL），绘制标准曲线，考察结果见表4。

表4 白术中5种化学成分线性关系考察结果Tab. 4 Results of linear relation of constents of AMR

2.3.6 精密度试验 按“2.1.3”项配制白术样品（S1）溶液后，按“2.3.2”项连续进样测定6次，计算新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、白术内酯Ⅲ和白术内酯Ⅱ含量，RSD分别为0.59%、0.62%、0.48%、0.89%和0.57%，表明仪器具有良好的精密度。

2.3.7 稳定性试验 按“2.1.3”项配制白术样品（S1）溶液后，按“2.3.2”项在0、2、4、8、12、24 h进样测定，计算新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、白术内酯Ⅲ和白术内酯Ⅱ的含量，RSD分别为0.89%、0.76%、0.59%、0.63%和0.84%，表明在24 h内供试品溶液具有良好的稳定性。

2.3.8 重复性试验 按“2.1.3”项配制白术样品（S1）溶液后6份，按“2.3.2”项进样测定，计算新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、白术内酯Ⅲ和白术内酯Ⅱ的含量，RSD分别为1.58%、1.89%、1.26%、1.67%和1.98%，表明该方法具有良好的重复性。

2.3.9 加样回收率试验 取白术样品（S1）粉末6份，每份0.5 g，加入混合对照品溶液（以50%甲醇为溶媒制成每1 mL含1.728 µg、3.648 µg、7.009 µg、5.682 µg和4.082 µg的新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、白术内酯Ⅲ和白术内酯Ⅱ的溶液）25 mL，余同按“2.1.3”项配制回收率样品溶液，按“2.3.2”项进样测定，计算各成分的回收率和RSD，见表5，回收率平均值均大于90%，RSD均小于3%，说明该方法测得的结果准确。

表5 加样回收率试验结果（n = 6）Tab. 5 Results of recovery standard addition（n = 6）

2.3.10 样品测定 按“2.1.3”项配制16批白术样品溶液后，按“2.3.2”项测定，计算其含量，见表6。

表6 16批白术中5种化学成分含量测定结果（mg/g，n = 2）Tab. 6 Determination of five chemicals of 16 batches of AMR（mg/g，n = 2）

3 讨论

本试验考察了不同提取溶剂、提取方式、提取时间和料液比对各成分提取效率的影响，最终确定供试品溶液的制备方法为以50%甲醇按料液比1.0 g∶25 mL回流提取30 min。在指纹图谱研究中，通过与对照品的保留时间及PDA光谱图对比，指认出新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ共7个成分。通过比较不同波长条件下各峰的响应值、分离度、对称性及拖尾因子等参数，最终选择221 nm作为指纹图谱的检测波长。

采用UPLC法对16批白术进行分析检测后，通过SPSS 25.0聚类分析，结合SIMCA14.1绘图软件，对21个共有峰的峰面积进行主成分分析，结果均将16批白术聚为3类，分类符合产地规律。主成分分析提取得到的前5个主成分的累积贡献率达到88.32%，其中白术内酯Ⅲ和白术内酯Ⅱ在主成分1中有明显贡献值，鉴于白术内酯类成分为白术的主要活性成分，因此将其纳入含量测定指标中。偏最小二乘判别分析以VIP值为筛选标准得到5个差异性标志成分，其中有3个峰被指认出，分别为绿原酸、隐绿原酸和新绿原酸，为含量测定指标的选择提供参考。

4 结论

本研究通过化学计量学结合超高效液相色谱法的分析方式，对白术的质量控制提供了一种评价思路，该方法表明白术质量与产地之间具有一定的相关性。本次研究收集的白术药材有一年生和两年生区别，但通过以上试验分析并未发现不同生长年限的白术质量存在差异，对于白术生长年限的研究或可以通过增大样本量、收集更长生长时间的白术药材加以研究，以期为白术质量控制和临床应用提供参考依据。