有机磷酸酯阻燃剂2-乙基己基二苯基磷酸酯多代暴露对大型溞生殖、发育及相关基因转录的影响

王云泽，袁思亮,2，孔 任，钱址松，李博群，刘春生

(1. 华中农业大学水产学院，湖北 武汉 430070； 2. 中国科学院水生生物研究所，湖北 武汉 430072)

近年来，随着各国对生态环境安全的重视，溴系阻燃剂(brominated flame retardants，BFRs)逐步被有机磷酸酯阻燃剂(organic phosphate flame retardants，OPFRs)所取代[1].2-乙基己基二苯基磷酸酯(2-ethylhexyl diphenyl phosphate，EHDPP)作为典型的OPFRs之一，被广泛应用于涂料、食品包装、电子设备及家具等各类产品中[2-3].由于EHDPP没有相应的化学键与产品相结合，所以极易释放到环境中[4].

大量研究结果表明，EHDPP广泛存在于大气、土壤、沉积物和地表水等环境介质中[4-9].北美安大略湖沉积物中EHDPP最高检出量为1.44 μg/g[10]；中国松花江地表水系中含EHDPP 6.6～94 ng/L[5]，西班牙纳隆河、阿尔加河和贝索斯河含EHDPP 15～46 ng/L[6]；污水处理厂尾水中EHDPP的最高检出量为5.4 μg/L[11].此外，EHDPP可以在生物体内蓄积，瑞典湖泊和菲律宾马尼拉湾水域渔获肌肉和脂质内分别含EHDPP 14和2.1 μg/g[12-13]，挪威斯瓦尔巴群岛的鱼体内含EHDPP 11.13～485.14 ng/g[14].

当今EHDPP有着极高的环境检出率，但关于EHDPP的毒性数据则不多，目前有限的报道显示EHDPP能够引发肝毒性、神经毒性、生殖毒性、发育毒性等系列毒性效应[15-18].例如，急性暴露于EHDPP后斑马鱼Barchydanioreriovar失去了对光暗刺激的反应，游泳行为受到抑制[15,19].Li等发现EHDPP能够与日本青鱂Oryziaslatipes胚胎中视黄酸受体(RAR)和视黄酸X受体(RXR)发生拮抗效应，降低RAR和RXR活性，从而影响胚胎的眼部发育[20].同时，EHDPP具有明显的母体转移特性，慢性暴露于EHDPP 35 d后，青鱂胚胎中EHDPP含量能够达到肌肉的1.5倍[20].在小鼠肿瘤细胞暴露中，EHDPP改变了参与线粒体活性、细胞存活及超氧化物生成等相关基因的表达[21].然而，以上研究都侧重于对脊椎动物或哺乳动物等高等生物的毒理学探究，EHDPP对低等水生无脊椎动物的毒性效应还有待研究.

大型溞Daphniamagna是一种小型甲壳类浮游动物，在生存环境适宜的条件下，营孤雌生殖[22]，具有生命周期短、繁殖能力强、基因型稳定等特点.当大型溞改变生殖策略开始进行两性生殖并产生休眠卵时，则可以推断其受到了环境胁迫[23-24]，因此大型溞常被用作毒理学实验的模式生物[25].基于此，本研究以大型溞为实验对象，探究EHDPP慢性暴露对大型溞生殖和发育的毒性效应，以及其相应的分子机制.

1 材料与方法

1.1 试验试剂

1.2 大型溞的养殖

本试验所使用的大型溞来自中科院水生生物研究所(武汉)，且在本实验室连续培养多代.使用过滤后的曝气自来水作为大型溞养殖水.大型溞日常养殖于光照培养箱中，光暗比为16 h∶8 h[26].使用5×107cell/mL的小球藻Chlorellapyrenoidosa作为大型溞的日常饵料，每2 d对大型溞进行换水及绿藻投喂，保证暴露水体中含绿藻1×105cell/mL，待大型溞开始产卵后加倍投喂[27].

1.3 慢性暴露试验

慢性暴露试验分为2个阶段.

第1阶段为F0大型溞的21 d慢性暴露试验：根据环境浓度设置4个暴露组(0.1、1、10、100 μg/L EHDPP)和1个溶剂(DMSO)对照组，每个暴露组设置4个平行，每个平行中放置50只幼溞(<24 h龄)和1 L暴露液，暴露期间记录大型溞体长和产溞数.

第2阶段进行F1及F2的试验：在亲代暴露的第21 天，收取大型溞幼溞(<24 h龄),将原先暴露于不同浓度组的大型溞分为连续暴露组和恢复组2部分，暴露组EHDPP质量浓度分别为0、0.1、1、10、100 μg/L，恢复组为无EHDPP的培养液.每个浓度设置3个平行，每个平行中放置30只幼溞和600 mL暴露液或培养液，记录大型溞体长、产溞数.采用半静态暴露法[28]，每2 d更换暴露液，并投喂绿藻.

1.3.1 终点指标测定

体长测定：暴露期间对第7、14和21天的亲代大型溞及暴露第20天的新生子代幼溞取样，每个暴露缸中选取7～10只大型溞置于体视显微镜下拍照，并通过软件Image Pro Plus (德国)测量体长.

生殖量测定：自大型溞性成熟开始，每天对大型溞的生殖数量进行统计，得到每只大型溞的平均累积产溞数.

1.3.2 实时荧光定量PCR

在暴露期间选取第7、14和21天的大型溞样品测定其生长、生殖及信号传导相关基因的转录情况.采用TRIzol法提取total RNA，2-ΔΔCt法分析数据，转录结果以倍数变化(fold change)形式呈现.选取bcl2为内参基因，生长生殖及信号传导相关基因参照文献[29-30]，如表1所示.

表1 大型溞生长和生殖相关基因引物序列Tab.1 The primer sequences of the genes related to the growth and reproduction of Daphnia magna

1.3.3 水样中EHDPP含量测定

F1大型溞暴露中期，在换水前后对暴露水体进行取样，用以检测暴露溶液中EHDPP的实际浓度.将4 mL水样装入玻璃瓶中，用4 mL二氯甲烷分3次萃取EHDPP，萃取完成后进行氮吹，并使用200 μL的甲醇复溶.过0.22 μm有机滤膜后使用岛津LC-ADXR高效液相色谱耦合AB3500三重四级杆质谱进行检测.该仪器液相色谱和质谱条件如下：

液相色谱(LC)分离在C18色谱柱上进行.柱温为40 ℃，进样量2 μL，流动相为甲醇(B)和含5 mmol/L乙酸铵、1/1 000甲酸的水(A)，流速为0.2 mL/min，梯度设定如下：0 min，5% B；2～4 min，100% B(线性)；8～10 min，5% B(线性).

质谱运行在多反应监测(MRM)模式下进行，采用电喷雾电离 ESI 正离子模式，气帘气25 psi，碰撞气9 psi，喷雾电压5 500 V，离子源温度350 ℃，雾化气25 psi，加热气25 psi.分别使用363 > 251和363 > 77离子进行EHDPP的定性和定量分析.

1.3.4 数据分析

所有数据均采用SPSS 25.0软件进行分析.使用单因素方差分析方法中的Tukey’s多量程检验来比较对照组与暴露组之间的差异，结果以P<0.05定义具有显著性差异.试验结果中所有图片均用软件Graphpad Prism 7绘制，数据结果均表示为平均值±标准差(M±SD).

2 结果

2.1 暴露液中EHDPP实际质量浓度

试验水体中EHDPP的理论质量浓度为0、0.1、1、10、100 μg/L，换水后的实际暴露质量浓度如表2所示，换水后水体中EHDPP质量浓度下降了16%～37%.

表2 暴露液中EHDPP质量浓度测定Tab.2 Determination of EHDPP content in exposure waters

2.2 EHDPP暴露对F0大型溞的毒性

2.2.1 EHDPP暴露对F0大型溞生长的影响

在暴露的第7、14和21天，对照组大型溞的体长分别为(1.46±0.05)、(2.80±0.03)和(3.28±0.06) mm，100 μg/L EHDPP暴露组中大型溞的体长分别为(1.36±0.05)、(2.62±0.09)和(3.14±0.08) mm，体长被显著抑制(图1a).相关基因转录结果(图1b)显示，在暴露的第7 天，0.1、1、10和100 μg/L 的EHDPP显著下调了大型溞细胞周期蛋白E1基因ccne的表达，相对表达量分别为0.47±0.24、0.50±0.14、0.53±0.12和0.50±0.10；在暴露的第14 天，100 μg/L EHDPP显著下调了ccne的表达量(0.46±0.02)；在暴露的第21天，100 μg/L EHDPP显著下调了细胞周期蛋白依赖性激酶6基因cdk6的表达量(0.61±0.06).

注：*代表P<0.05，以下同.

2.2.2 EHDPP暴露对F0大型溞生殖的影响

EHDPP的慢性暴露对大型溞的生殖数量无显著影响(图2a)，但EHDPP慢性暴露后，F1大型溞的体长受到了影响(图2b)：对照组中F1幼溞的体长为(0.81±0.02) mm，10 μg/L EHDPP暴露组中F1幼溞的平均体长为(0.85±0.02) mm，被显著促进；100 μg/L EHDPP暴露组中F1幼溞的平均体长为(0.79±0.01) mm，被显著抑制.此外，100 μg/L EHDPP暴露后F1个体中出现了雄性个体，其占比为46.81%±7.67%.进一步分析3个生殖相关关键基因(幼年激素酯酶基因jhe、蜕皮激素受体A 基因ecra和卵黄蛋白原基因vtg-1)的转录水平(图2c)后发现：在暴露第7天，100 μg/L EHDPP显著下调了基因vtg-1的表达(046±0.19).在暴露的第14天，0.1、1和100 μg/L EHDPP暴露显著下调了jhe基因的表达，其相对表达量分别为0.31±0.21、0.31±0.16和0.17±0.07；100 μg/L EHDPP暴露后ecra(0.63±0.06)和vtg-1(0.33±0.19)表达量也被显著下调.在暴露的第21天，10 和100 μg/L 的EHDPP显著下调了jhe的表达，其表达量分别为0.37±0.22和0.50±0.11；此外，100 μg/L的EHDPP上调了基因vtg-1的表达量(2.07±0.54).

图2 EHDPP暴露对F0大型溞生殖量、F1新生儿体长及F0生殖相关基因表达的影响 Fig.2 The effect on the reproduction, the transcriptions of genes related to reproduction in F0 generation and the body length of F1 generation newborns after exposure to EHDPP

2.3 EHDPP暴露对F1大型溞的影响

2.3.1 EHDPP暴露对F1大型溞生长的影响

由图3a可见，在F1连续暴露组中，在暴露的第7、14、21天，对照组中大型溞的体长分别为(2.43±0.13)、(3.02±0.14)和(3.64±0.82) mm，100 μg/L EHDPP连续暴露组中大型溞的体长分别为(2.20±0.32)、(2.82±0.60)和(3.03±0.82) mm.与对照组相比，大型溞的体长分别下降了9.47%、6.62%和16.76%，被显著抑制.转录结果(图3b)显示，在暴露的第7天，100 μg/L EHDPP暴露下调了大型溞基因ccne的表达量(0.71±0.01)；在暴露的第21 天，100 μg/L EHDPP显著下调了cdk6的表达量(0.73±0.05).

在恢复的第7、14和21天，对照组大型溞的体长分别为(2.49±0.18)、(3.11±0.21)和(3.71±0.11)mm，100 μg/L EHDPP恢复组的大型溞体长分别为(2.16±0.40)、(2.73±0.58) 和(3.28±0.84) mm，体长的抑制率分别为13.25%、12.22%和11.59%(图3c).转录结果显示，在恢复的第7天，100 μg/L EHDPP恢复组中ccne的表达量被显著下调(0.43±0.12)，其余时间点相关基因转录水平均无显著变化(图3d).

2.3.2 EHDPP暴露对F1大型溞生殖的影响

100 μg/L EHDPP连续暴露能够促进大型溞的生殖量.在暴露的第18和20天，对照组产溞数为(13.21±2.98)和(17.83±3.04)只，100 μg/L EHDPP连续暴露组中大型溞的产溞数为(20.81±1.87)和(33.33±6.68)只，被显著促进(图4a).此外，在F2幼溞中也发现了雄性个体，占比为36.84%±5.26%.基因转录结果(图4c)显示，在连续暴露的第7天，100 μg/L EHDPP显著下调了大型溞生殖相关基因ecra(0.59±0.11)和vtg-1(0.15±0.09)的转录水平；在暴露的第21天，100 μg/L EHDPP连续暴露显著下调了大型溞生殖相关基因jhe的转录水平(0.63±0.22)，同时，0.1 μg/L EHDPP连续暴露显著下调了vtg-1的表达量(0.47±0.15).

图3 EHDPP暴露后F1暴露组及恢复组大型溞的体长和相关基因的表达量Fig.3 The growth and the transcription of genes related to growth of F1 generation in the exposure group and recovery group after exposure to EHDPP

图4 EHDPP暴露后F1暴露组及恢复组大型溞生殖量和相关基因的表达量Fig.4 The reproduction and the transcription of genes related to reproduction of F1 generation in the exposure group and recovery group after exposure to EHDPP

在恢复的第16、17和18天，对照组中大型溞的产溞量分别为(9.50±0.49)、(9.58±1.51)和(15.54±4.27)只，100 μg/L EHDPP恢复组中的大型溞产溞数分别为(17.69±1.11)、(17.86±1.18)和(24.04±1.50)只，增加了46.30%、46.36%和35.36%，均有显著提高(图4b).同时，在F2幼溞中也发现了雄性个体，占比为36.11%±4.81%.在恢复的第7天，相较于对照组，100 μg/L恢复组中jhe的表达量被显著上调(2.09±0.66)；在恢复的第14和21天，100 μg/L EHDPP下调了恢复组中jhe的转录水平，相对表达量分别为0.49±0.16和0.34±0.23(图4d).

2.4 EHDPP暴露对F2大型溞的影响

如图5a，连续暴露试验中对照组大型溞体长为(2.34±0.22) mm，100 μg/L EHDPP组中体长为(2.23±0.63) mm，无显著差异，但出现了大型溞的体长分化.恢复组中，对照组大型溞的体长为(2.55±0.12) mm，100 μg/L EHDPP组中大型溞体长被显著抑制，为(2.07±0.45) mm.

图5 EHDPP暴露7 d对F2暴露组及恢复组体长和相关基因表达的影响Fig.5 The effect on the growth and the transcription of genes related to growth of F2 generation in the exposure group and recovery group after exposure to EHDPP

基因表达结果如图5b所示，100 μg/L EHDPP的连续暴露下调了基因cdk6(0.53±0.16)和cdc25c(0.59±0.21)的表达量.基因ccnb的表达量被下调(0.71±0.24)，但不具统计学意义.100 μg/L EHDPP恢复组中大型溞生长相关基因cdc25c的表达量被显著上调(1.93±0.24).

3 讨论

本试验根据传统毒理学测试方法[28]评价EHDPP对大型溞生长、生殖的影响.对暴露水体的检测发现，换水后水体中EHDPP质量浓度下降了16%～37%.Li等[20]的研究发现，名义质量浓度为40 μg/L的EHDPP暴露水体，暴露日本青鱂24 h后，水体实际测量质量浓度为(1 161±347) ng/L，暴露35 d后青鱂的脑、肝、肌肉、卵巢及胚胎中分别含EHDPP(2 092±25.2)、(2 493±44.9)、(4 166±21.8)、(3 193±694)和(4 824±97.5) ng/g，出现了较大程度的降解和生物富集，这与本研究的结果相一致.也有研究表明，EHDPP可以在水生生物甚至人体内发生蓄积[13].此外，EHDPP的生物半衰期为4.23 d[31]，说明暴露水体中EHDPP含量的下降可能是由其自然降解和生物蓄积共同作用所导致.

大型溞的体长一直是大型溞生长的重要指标，体长增加后游泳能力增强，同时卵囊空间增大，更有利于卵的发育和生长[32].有报道显示，多种OPFRs慢性暴露后大型溞的体长受到显著抑制[33-35]，这与本研究中EHDPP抑制大型溞生长的结果相一致.本研究中的基因转录结果显示，100 μg/L EHDPP慢性暴露21 d后，F0大型溞生长相关细胞循环途径中细胞周期蛋白基因ccne和细胞周期蛋白依赖性激酶基因cdk6的表达量被显著下调.细胞周期途径能够在细胞分裂G1时期被多能干细胞(PSC)激活，进而通过调控相关发育基因表达来调控细胞分化[36]，是大型溞生长十分重要的代谢通路[37].由此推测，EHDPP慢性暴露可能导致大型溞营养摄取能力减弱进而干扰正常细胞生长周期，最终影响大型溞的生长.大型溞的雌雄分化受到幼年激素JH-信号通路的控制[38].正常情况下，大型溞体内幼年激素酯酶水平足够将体内日常累积的幼年激素(JH)水解成无生物活性的JH-酸，当环境出现胁迫时，幼年激素酯酶基因jhe的下调会引起大型溞体内幼年激素酯酶水平的下降，从而导致大型溞体内JH的大量累积，干扰大型溞的生殖[39].本试验转录结果显示，F0大型溞在暴露于100 μg/L EHDPP后的第14和21天，jhe基因都出现了显著下调，说明EHDPP可能会引起细胞周期紊乱和激素水平变化从而干扰大型溞正常生长生殖.

连续暴露试验中，F1最高浓度暴露组中大型溞体长的差异随时间的延长而增加.之前有多代暴露试验发现，大型溞持续暴露于心得安(propranolol)直到F2才出现其体长的显著性差异[40]，在持续热胁迫中也发现，多代暴露后从F0到F3，大型溞的生长速率持续加快[41]，说明在持续暴露下化学品对大型溞的影响可能会随暴露时间的延长而加剧.转录结果显示，连续暴露于100 μg/L EHDPP后F1大型溞的细胞周期蛋白基因ccne和细胞周期蛋白依赖性激酶基因cdk6被下调，这与F1大型溞生长的抑制效应相一致.此外，生殖相关幼年激素酯酶基因jhe的表达量下调，可能是F2大型溞中雄性个体出现的原因之一.但整个研究过程中并没有休眠卵(卵鞍)的出现，表明100 μg/L EHDPP的胁迫可能并不足以迫使大型溞的休眠卵产生.100 μg/L EHDPP恢复组中F1大型溞的体长出现显著性差异且这种差异持续到了F2代，同时F2大型溞中也有雄性个体出现.已有研究发现，EHDPP能够在生物肌肉、脂质及性腺中累积[12,42]，说明EHDPP可能存在一定的慢性毒性，对子代发育有着潜在威胁.转录结果显示，在100 μg/L恢复组中，生殖高峰期时大型溞幼年激素酯酶基因jhe的表达量被下调，细胞周期蛋白基因ccne的表达量只在生长早期出现显著性下调，说明EHDPP暴露能够对大型溞造成持续性影响，但毒性可能随着恢复时间的延长而减弱.以往的研究表明，EHDPP能够在水生生物体内蓄积[13]，1.16 μg/L EHDPP暴露能引发日本青鱂性腺中EHDPP的累积，出现明显的母体传递效应[20].另一项研究也发现，大型溞经过铀慢性暴露后恢复组中能持续检测到铀的存在，且对存活率及生长速率的影响会持续到F2代[32].由此可见，EHDPP可能会在大型溞体内累积，进而对多代大型溞造成持续性影响.

4 结论

本研究结果显示，EHDPP暴露对大型溞的生殖、发育都展现出较高的毒性.暴露于100 μg/L EHDPP中的大型溞，其F0、F1、F2及恢复组中F1、F2的体长显著降低，影响了大型溞正常的孤雌生殖，在F1、F2的暴露组和恢复组中出现一定比例的雄性个体.综上，EHDPP对大型溞具有持续毒性效应和母体传递效应.