连翘苷对胃癌细胞AGS增殖、迁移和侵袭的抑制作用

邓 明， 邓 芳， 陈志坚， 周福生

(1.广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州 510405；2.广州中医药大学脾胃研究所，广东 广州 510405)

胃癌的发病率和死亡率均较高，严重威胁人类生命健康[1]。胃癌复发、转移是导致死亡的主要原因，减弱细胞迁移和侵袭对肿瘤复发、转移有抑制作用，能够改善患者预后[2]。近年来，中草药或其活性成分具有作用靶点多、副作用小等优点，其抗肿瘤作用也备受关注。连翘苷是中药连翘的主要活性成分之一，具有抗氧化[3]、抗炎[4]、抗衰老[5]等功效。研究显示，连翘苷可通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路降低肾癌细胞的生长、迁移和侵袭[6]。但目前，连翘苷对胃癌细胞机制研究还未知。长链非编码RNA(lncRNA)是一类与人类肿瘤发生发展密切相关的RNA，可作为肿瘤治疗和诊断的靶点[7-9]。外泌体复合物7(EXOC7)是一种lncRNA，其在胃癌患者的血清和癌组织中表达升高，且其高表达与胃癌临床分期、浸润深度、分化程度、淋巴结转移等临床病理特征密切相关，可能成为胃癌早期诊断及病情判断的潜在生物学指标[10]。因此，本研究主要探讨连翘苷可能通过调控EXOC7对胃癌细胞AGS增殖、迁移和侵袭的影响，以期为其研究与应用提供依据。

1 材料

胃癌细胞AGS购自中国科学院上海细胞库。连翘苷(纯度≥98%，批号20180619)，购自南京广润生物制品有限公司。胎牛血清(FBS，批号20181225)，购自浙江天杭生物科技有限公司；TRIzol试剂(批号55362985)、LipofectamineTM2000试剂盒(批号1464348)，购自美国Invitrogen公司；RPMI 1640培养基(批号20180915)、细胞计数试剂盒-8(CCK-8，批号20181123)、二喹啉甲酸(BCA)试剂盒(批号20181028)，购自北京索莱宝科技有限公司；逆转录试剂盒(批号AK4856)、PCR试剂盒(批号AK15028)，购自日本TaKaRa公司；PCR引物、si-EXOC7、si-NC、pcDNA-EXOC7、pcDNA，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；兔抗人Ki67(批号45585995)、基质金属蛋白酶2(MMP-2，批号15265585)、基质金属蛋白酶9(MMP-9，批号25465855)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)多克隆抗体(批号36542115)，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

2 方法

2.1 细胞培养和转染 AGS细胞用含10% FBS的RPMI 1640培养基培养。AGS细胞接种于6孔板，按照LipofectamineTM2000试剂盒说明书操作，分别转染si-EXOC7、si-NC、pcDNA-EXOC7、pcDNA。

2.2 细胞分组 参考文献[6]报道，将未转染细胞分为对照组，5、10、20 μmol/L连翘苷组。对照组细胞用常规培养基培养24 h；5、10、20 μmol/L连翘苷组细胞分别用含5、10、20 μmol/L连翘苷的培养基培养24 h。转染si-EXOC7、si-NC正常培养24 h，记为si-EXOC7组、si-NC组。转染pcDNA-EXOC7、pcDNA用含20 μmol/L连翘苷的培养基培养24 h，记为20 μmol/L连翘苷+pcDNA-EXOC7组、20 μmol/L连翘苷+pcDNA组。

2.3 CCK-8法检测细胞增殖 将各组细胞细胞接种于96孔板，按“2.2”项下分组处理，培养24 h，每孔加入10 μL CCK-8试剂，孵育2 h，于酶标仪450 nm波长处检测光密度(OD)值。以OD值表示细胞增殖活力。

2.4 Transwell法检测细胞迁移和侵袭 取100 μL细胞悬液均匀铺于Transwell小室上室，下室加入500 μL培养基。按“2.2”项下分组处理，培养24 h后多聚甲醛固定30 min，结晶紫染色15 min，在显微镜200倍视野下观察并拍照，计数并评价细胞迁移能力。侵袭实验以Matrigel基质胶铺于Transwell上室，自然晾干，其余步骤同迁移实验。

2.5 Western blot法检测细胞中Ki67、MMP-2、MMP-9蛋白表达 RIPA试剂提取各组细胞中总蛋白，BCA法进行蛋白定量，10% SDS-PAGE电泳，湿转至PVDF膜，于5%脱脂奶中封闭1 h，加Ki67(1∶500)、MMP-2(1∶1 000)、MMP-9(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 500)一抗，4 ℃孵育过夜，加辣根过氧化酶标记的IgG，37 ℃孵育1 h，通过化学发光试剂进行避光显影，曝光拍照。Image J软件对蛋白条带进行分析，以GAPDH为内参，计算目的蛋白相对表达。

2.6 RT-qPCR检测细胞中EXOC7 mRNA表达 采用TRIzol试剂从细胞中提取总RNA，逆转录系统将RNA反转录为cDNA，进行PCR扩增。引物序列为EXOC7正向引物5′-GATACTTGACTCATYAGAC-3′，反向引物5′-ACTTCTAC TCTCATGATC-3′；内参GAPDH正向引物5′-GATCGTGGC CATCAATGACC-3′，反向引物5′-ACCTGCATCACCCCACTTAA-3′。采用2-ΔΔCT法计算EXOC7 mRNA相对表达。

3 结果

3.1 连翘苷对AGS细胞增殖的影响 与对照组比较，各浓度连翘苷组AGS细胞增殖活力和Ki67蛋白表达均降低(P<0.05)，且呈剂量依赖性，见图1、表1。

表1 连翘苷对AGS细胞增殖活力和Ki67蛋白表达的影响

3.2 连翘苷对AGS细胞迁移和侵袭的影响 与对照组比较，各浓度连翘苷组AGS细胞迁移和侵袭数以及MMP-2、MMP-9蛋白表达均降低(P<0.05)，且呈剂量依赖性，见图2、表2。

表2 连翘苷对AGS细胞迁移、侵袭及MMP-2、MMP-9蛋白表达的影响

3.3 连翘苷对AGS细胞中EXOC7 mRNA表达的影响 与对照组比较，各浓度连翘苷组AGS细胞中EXOC7 mRNA表达降低(P<0.05)，且呈剂量依赖性，见表3。

表3 连翘苷对AGS细胞中EXOC7 mRNA表达的影响

3.4 抑制EXOC7表达对AGS细胞增殖、迁移和侵袭的影响 与si-NC组比较，si-EXOC7组AGS细胞中EXOC7 mRNA表达降低，增殖活力、迁移和侵袭数以及Ki67、MMP-2、MMP-9蛋白表达降低(P<0.05)，见图3、表4～5。

表4 抑制EXOC7表达对AGS细胞增殖活力和Ki67蛋白表达的影响

3.5 过表达EXOC7对AGS细胞增殖、迁移和侵袭的影响 转染pcDNA、pcDNA-EXOC7的细胞中EXOC7 mRNA表达分别为(1.01±0.05)、(1.87±0.13)，2组比较差异显著(P<0.05)，表明pcDNA-EXOC7转染成功，细胞中EXOC7 mRNA表达升高。与20 μmol/L连翘苷+pcDNA组比较，20 μmol/L连翘苷+pcDNA-EXOC7组AGS细胞增殖活力、迁移和侵袭数及Ki67、MMP-2、MMP-9蛋白表达升高(P<0.05)，见图4、表6～7。

表5 抑制EXOC7表达对AGS细胞迁移、侵袭及MMP-2、MMP-9蛋白表达的影响

表6 过表达EXOC7对AGS细胞增殖活力及Ki67蛋白表达的影响

表7 过表达EXOC7对AGS细胞迁移、侵袭及MMP-2、MMP-9蛋白表达的影响

4 讨论

连翘是我国传统中药，具有清热解毒、消肿散结等功效。连翘在我国的地理分布范围广，可广泛种植，具有较好的开发价值。连翘苷作为连翘的主要活性成分之一，其药理活性有待深入探究。研究显示，连翘苷可通过降低VEGF、升高ET-1抑制肺癌细胞发展[11]。本研究采用不同浓度连翘苷干预体外培养的胃癌细胞AGS，探究连翘苷对AGS细胞增殖、迁移和侵袭的影响及分子机制。

细胞增殖紊乱可导致肿瘤发生，抑制肿瘤细胞增殖可延缓肿瘤发展进程[12]。Ki67蛋白参与调控细胞周期，可以反映细胞增殖[13]。本研究显示，不同浓度连翘苷作用胃癌细胞AGS后，细胞增殖活力和Ki67蛋白表达降低，表明连翘苷可抑制AGS细胞增殖。肿瘤细胞迁移和侵袭可影响肿瘤复发、转移，MMP-2、MMP-9可以促进细胞外基质降解以及肿瘤细胞的迁移和侵袭[14-15]。连翘苷可以降低AGS细胞迁移和侵袭数，降低MMP-2、MMP-9蛋白表达，表明连翘苷可以抑制AGS细胞迁移和侵袭。

lncRNA在真核生物体内广泛存在，与肿瘤的发生发展密切相关[16]。作为一种lncRNA，EXOC7在宫颈鳞状细胞癌[17]和肝细胞癌[18]中表达升高，可作为肿瘤的分子标志物。本研究通过转染EXOC7干扰RNA降低AGS细胞中EXOC7表达后，细胞增殖活力、迁移和侵袭数降低，Ki67、MMP-2、MMP-9蛋白表达降低，表明降低EXOC7可以抑制AGS细胞增殖、迁移和侵袭能力。进一步研究显示，过表达EXOC7逆转了连翘苷对AGS细胞增殖、迁移和侵袭的作用，提示连翘苷可能通过降低EXOC7表达发挥抗胃癌作用。

综上所述，连翘苷可抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭，其作用机制与降低EXOC7表达有关。