基于悬滴法的肺内液表面张力测量系统研制

沙敬新，薛昊轩，李宪龙，陈正龙，陶嘉乐，李逸明

在人体气道和肺泡表面覆盖有一层连续液体薄膜，称为肺内液[1]。在大的气道中，这一薄膜是由黏液凝胶层和纤周层组成的双层液体，而在远端细支气管和肺泡中，它逐渐过渡到由肺表面活性剂膜[2]所覆盖的水性下相构成的单层液体。肺表面活性物质可以降低肺泡气液界面的表面张力，保持肺泡的稳定性，对维持肺的正常呼吸力学具有非常重要的作用[3，4]。肺泡表面张力随呼气运动时肺泡表面积的减小而减小，根据Young-Laplace方程，肺泡向内的弹性回缩力减小，有效避免了肺泡在呼气末期的不稳定性。同样，较低的表面张力可以减小气道液体层中的负压，避免气道塌陷。此外，肺内液体的渗出也受到表面张力的影响。例如在肺水肿患者中，肺泡衬里液表面张力的增加可能会导致组织间隙液和肺泡内液体之间的压力梯度增大，从而导致液体从组织间隙渗入肺泡空气腔中。

在临床急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）患者的机械通气中发现，肺泡表面张力的改变会导致机械通气时的容积伤或者剪切伤[5]。通常使用较高的呼气末正压和肺复张动作来预防呼吸机相关性肺损伤[6]，而呼吸机相关性肺损伤的计算模型[7]进一步表明，肺内液的表面张力对肺复张压或气道重新开启压力有重要影响。早产儿由于缺乏肺表面活性物质，可能会罹患新生儿呼吸窘迫综合征[8]（neonatal respiratory distress syndrome，NRDS）。出生后给予外源性表面活性物质已成为NRDS标准临床治疗措施[9]。Filoche M团队的一项研究表明[10]，表面活性剂混合药物的表面张力决定了表面活性剂的给药效率及其在气道中分布的均匀性。因此，测量气道表面液体的表面张力，无论是制定肺保护性通气策略，还是在优化表面活性剂治疗方案方面都具有重要的临床意义。

目前表面张力的测量技术主要有Langmuir-Wilhelmy天平法[11]、捕获气泡法[12]、悬滴法[13]等。天平法除了能够测量表面张力外，也被用来测量表面压力-表面积等温线[1]。虽然操作简单，但是所需样本量大，同时存在表面活性剂膜泄漏的问题，因此不适用于表面张力的动态测量。捕获气泡法不存在膜泄漏的问题，能够再现肺泡环境，然而该方法受到光学限制，不适用于不透明的混浊液体的研究。悬滴法很好地克服了以上测量方法的缺点，不仅所需样本量小，而且允许测量动态和超低表面张力，因此非常适合测量肺内液这类量少且珍贵的液体。笔者设计了一套基于悬滴法的肺内液表面张力测量实验装置，就悬滴法的原理、软硬件设计、实验结果和测量误差进行了详细的介绍。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验硬件及软件

实验装置的硬件部分包括：环形灯（Model YRL-74-60-W）、电源适配器（Model YNAPS-24W24-2T）、滤光片（蓝色）（飞尔光学技术有限公司，中国），一次性无菌注射器（2.5 mL）、注射器针头（内径0.84 mm）（康德莱公司，中国），光学显微镜头、电荷耦合器件型（charge coupled device，CCD）相机（MER-500-14GC）（大恒公司，中国），带刻度的二维光学移动平台（深圳丰华精机有限公司，中国）。

实验装置的软件部分包括：相机配套软件GigE IP Configurator（×64）和Daheng MER-Series Viewer（×64）软件，Visual Studio 2017（微软公司，美国）。

1.1.2 实验样本

（1）标准液样本：二甲基硅油[道康宁（中国）有限公司]（黏度350 cP，密度0.970 g/cm3）和纯水。二甲基硅油表面张力标准值21.10 mN/m（25℃）；水的密度0.997 g/cm3，水表面张力标准值72.00 mN/m（25℃）。

（2）临床标本：在复旦大学附属中山医院手术重症监护病房招募了5例接受机械通气的ARDS患者，取得其肺内液（与患者签订知情同意书，获得伦理委员会证明）。

1.2 方法

1.2.1 悬滴法基本原理

悬滴法测量液体表面张力的原理[14，15]：当液滴静止悬挂于毛细管口时，其外形由重力和表面张力共同决定且为轴对称图形（图1）。通过对液滴外形轮廓的采集，根据重力和表面张力平衡的关系即可求得液体表面张力。该方法基于Young-Laplace方程，在液滴表面上任意一点P（x，z）建立方程：

其中：ΔP表示P点界面上的压力差；R1、R2为P点处的第一和第二曲率半径；γ为液体的表面张力。当液滴在表面张力和重力作用下处于平衡状态时，液滴的压强符合如下规律：

其中：ΔP0为悬滴液顶点处界面的压力差；Δρ为悬滴界面的密度；g为重力加速度。根据静力平衡与曲率半径几何关系，得到：

其中：R0表示原点处的曲率半径；θ为P点的法线与对称轴的夹角；β被称为形状因子。

通过边角的相互关系和4阶Runge-Kutta法求解方程式（3），可以得到液滴的理想曲线。每一个形状因子β都对应一条拟合曲线，在β的变化范围内可以得到一组不同的拟合曲线（xi，zi），i=1，2，3，…，n，该拟合曲线与液滴的实际轮廓点（Xi，Zi）之间距离的平方和作为目标函数：

目标函数E是关于β、R0的函数，其求解过程计算量大，通常利用单纯形法和二阶Newton-Raphson求解[13]。目标函数（5）满足收敛条件且取最小值时得到β和R0的解，根据方程式（4）可知，只要确定了β、R0也就确定了表面张力γ。这种将液滴的实际轮廓与理论曲线拟合的计算表面张力的方法称为轴对称液滴形状分析法。见图1。

图1 悬滴几何外形示意图Fig.1 Geometry schematic diagram of pendant drop

1.2.2 悬滴法边缘检测方法

悬滴法测量表面张力需要获得液滴的几何图形，对液滴图形提取轮廓后进行数据处理。轴对称液滴形状分析算法对图像精度要求十分严格，要求图像边缘清晰，检测过程中错误率低、定位准确。常用的边缘检测算法[16]有Sobol算子、Prewitt算子和Canny算子等。Sobol算子和Prewitt算子均对边缘定位的准确度不高，无法达到轴对称液滴图像分析算法对图像的精度要求。在这一点来讲，Canny算子相比于其他算子更为优异。

该装置采用OpenCV图像处理库中的Canny算子来提取液滴轮廓边缘。Canny算子边缘检测的原理是通过图像信号函数的极大值来判定图像的边缘像素点，主要包含以下4个步骤。

（1）高斯滤波：其主要目的是降噪，用一个高斯矩阵乘以每一个像素点及邻域，取其权重的平均值作为最后的灰度值。

（2）计算梯度值和梯度方向：通常图像中灰度值的变化程度和方向用梯度表示。点乘Sobel或者其他算子获得x方向的偏导矩阵Gx和y方向的偏导数矩阵Gy，综合以下公式计算梯度值和方向：

（3）过滤非最大值：从上一步得到的梯度图像存在边缘粗宽、弱边缘干扰等众多问题，通过寻找像素局部的最大值，将非极大值点所对应的灰度值设置为0，以剔除大部分非边缘的像素点。

（4）双阈值算法检测图像边缘：设置高阈值和低阈值进行边缘检测，将小于低阈值的点定为假边缘置0，将大于高阈值的点定为强边缘置1；对于中间的像素点，如果与确定为边缘的像素点邻接，则判定为边缘，否则为非边缘。

图2为温室下采集到的水滴图像，A为液滴源图像，B为Canny算子提取液滴边缘轮廓的效果图。

图2 Canny算子边缘检测Fig.2 Images of edge detection by Canny detector

1.2.3 实验装置设计

（1）硬件部分：实验装置主要由光源、散光片、液滴形状产生装置、图像采集装置和计算机等部分组成（图3）。光源部分包括环形灯和电源适配器，提供不同强度的平行光。滤光片在保证光照强度的同时有效地减少色差的影响，避免出现水滴边缘图像的模糊和失真。液滴形状产生装置包括一次性无菌注射器和注射器针头等，注射器针头末端已磨成圆平面（由于液滴轮廓距针头末端有一小段距离，针头末端平面对液滴图片质量基本无影响）。图像采集装置包括光学显微镜头、CCD相机及带刻度的二维光学移动平台，通过光学镜头和CCD相机的配合使用，可以有效地减少对焦不准和光学畸变的影响，进而提高液滴图像的质量；计算机主要用来控制CCD相机、存储采集到的图片和计算表面张力。

图3 实验装置示意图Fig.3 Schematic diagram of experimental device

实验过程中需注意以下几点：①避免振动因素影响图像获取，最好将整个实验放置在减振实验台上；②为保证后期图像处理中坐标与测距准确，实验前应采用水平管调节液滴产生装置处于水平位置。

（2）软件部分。根据测量需求，该装置采用大恒公司配套软件GigE IP Configurator（×64）取得相机IP与计算机保持通信，利用Daheng MER-Series Viewer（×64）软件控制相机获取图像，采用Visual Studio 2017开发相应程序以实现如下功能。①读入相机采集的图片，调用OpenCV图像处理模块对图像进行边缘提取等预处理。②依据针管的实际尺寸标定图像放大倍率，通过鼠标获取轮廓上需要的像素点。③通过Runge-Kutta和Newton迭代求解Young-Laplace方程和目标函数，得到β和R0值。④输入两相密度值，根据公式（4）得出表面张力。其中，调用OpenCV图像处理模块对液滴进行包括灰度处理、平滑滤波、图像缩放，边缘提取等一系列操作在内的图像处理。提取液滴轮廓边缘之后，利用图像处理库中的At函数遍历整个图形像素，通过坐标判断求得轮廓边缘坐标点，进而利用轴对称液滴形状分析算法求解表面张力。图像处理流程和算法处理过程见图4。

图4 Visual Studio 2017图像算法处理流程图Fig.4 Flowchart of Visual Studio 2017 image algorithm processing

1.2.4 验证方法

实验在室温（25℃）下进行，选择具有可靠表面张力数据的二甲基硅油及纯水作为标准液对实验装置的可靠性和测量精准度进行验证。实验过程中保证光源、液滴和相机镜头在同一直线上。CCD相机与液滴位置固定，镜头聚焦在液滴上，使所得照片准确清晰。推动注射器形成液滴，待液滴颈部出现拐点之后，微调注射器，尽可能使液滴处于最大、最饱满的形状。为了保证采集到具有良好变形形状的大液滴，将相机拍摄时间间隔设置为250 ms，在相机连续拍摄得到的一系列图片中选择液滴刚好脱落瞬间的前一张图片（颈部区域出现拐点），对采集的图像进行轮廓提取和表面张力的计算。每个样品重复测量30滴液滴，计算其表面张力。并与实验室现有的表面张力仪SDC-200（盛鼎公司生产的商用表面张力仪，采用悬滴选面法[1]测量表面张力）所测得的同一样本数据进行对比，验证该实验装置的准确性。

1.2.5 临床试验

采用实验装置对取自复旦大学附属中山医院重症监护病房5例ARDS患者的肺内液进行了表面张力的测量。该研究由医院的机构审查委员会批准，并获得了患者或其代理人的书面知情同意。受样本量的限制，每种样本的试验次数并不一致：1～3号样本量极少，只进行了10次重复试验；4号样本和5号样本分别进行了29次和54次试验。

2 结果

2.1 标准液表面张力验证

通过计算可知笔者实验装置测得水和硅油表面张力值分别为（72.35±1.00）mN/m、（21.38±0.60）mN/m。二者的测量值与标准值相比，误差分别为0.48 %、1.33%。利用SDC-200表面张力仪测得二者的表面张力为（71.55±1.03）mN/m、（20.76±1.03）mN/m。误差分别为0.62%、1.61%。由此可知，与商用表面表面张力仪相比，笔者实验装置具有较高准确度。

2.2 急性呼吸窘迫综合征患者肺内液表面张力

在所测得的表面张力数据中，1～3号样本肺内液表面张力的均方差都较小（≤0.57 mN/m），4、5号样本肺内液表面张力存在较大的波动。在5例肺内液样本测量结果中最小值为12.22 mN/m，最大值为35.11 mN/m。正常人的肺内液表面张力值约为30 mN/m，试验证明了在疾病状态下肺内液表面张力会发生变化，潜在影响患者的呼吸力学。见图5。

图5 5例ARDS患者肺内液表面张力测量结果Fig.5 Measurement results diagrams of pulmonary fluid surface tension in 5 ARDS patients

3 讨论

首先讨论该测量装置的不确定度。Shardt N和Elliott JAW[17]报道温度波动对绝大多数化合物表面张力的影响小于0.25 mN/（m·K）。该实验中温度变化严格控制在1℃以内，因此由温度引起的不确定度小于0.25 mN/（m·K）。实验测得的肺内液最大表面张力小于35.11 mN/m，因此该测量不确定度对应大约0.71%的相对误差。此外，根据误差传播原理[18]及公式（4），表面张力的相对误差公式为：

等式右侧第一项表示流体密度测量的不确定度，通常小于0.2%。第二项为重力加速度不确定度，由于实验中重力加速度恒定不变，因此可以忽略不计。最后两项源于图像边缘检测时随机扰动所致的误差，Saad SMI和Neumann AW[19]的研究表明该两项误差和小于1%。综上所述，从每个误差源传播到γ总的不确定度小于2%。

研究表明[3，6]ARDS、新型冠状病毒肺炎等肺部疾病通常伴有肺内液体表面张力和流变学特性的异常改变，有可能导致上述疾病机械通气治疗时引起呼吸机相关性肺损伤。因此，肺内液表面张力的定量测量对临床机械通气压力的设置有重要的参考价值。1～4号临床样本的表面张力值略低于正常值，而5号临床样本的表面张力接近30 mN/m。这一实验数据表明肺内液表面张力在不同的患者表现出很大的差异性。测量肺内液或者外源性表面活性剂的表面张力有利于将生理学原理与临床数据相结合，探究疾病发展进程，对于治疗呼吸窘迫综合征具有重要的临床意义。临床试验的样本均为疾病状态下的肺内液，黏度较大且分布不均，在运输过程中存在振荡问题，因此表面张力测量数据存在波动。4、5号样本误差可能的原因在于：①样本内存在血色状黏稠物；②液滴中存在气泡。其中，由于样本黏度较大导致液滴中存在气泡且难以排空，对液滴形状造成影响，不满足悬滴法测量表面张力原理中液滴形状只受液滴本身重力和表面张力的作用的限制性条件。

4 结论

实验研究设计了基于悬滴法的肺内液表面张力测量装置，悬滴图像经过Canny算子提取边缘之后，利用轴对称液滴形状分析算法将Young-Laplace方程与液滴边缘进行拟合，从而求解表面张力。笔者设计的装置不仅可以用于肺内液表面张力的测量，在外源性表面活性剂的快速吸附成膜、表面活性剂膜的低压缩性等相关特性的研究方面也具有一定的优势。试验对5例ARDS患者病理状态下的肺内液进行了测量，发现在所测量的样本中，表面张力最大值为35.11 mN/m，最小值为12.22 mN/m，测量的均方差均小于0.57 mN/m。同时，试验发现肺内液测量样本的质量（是否夹杂气泡或者血色黏稠状物等）对测量结果具有非常大的影响。该装置仍然存在许多需要改进的地方，由于振动对实验结果影响很大，可以考虑对实验装置进行机械设计，构建减振平台；肺内液的表面张力的临床数据一般是在37℃条件下测量的，因此可以考虑在实验装置中加入温控模块，以获得更加准确和可信的数据。