白屈菜红碱PLGA纳米粒的制备及其体内药动学研究

徐志杰

(威海海洋职业学院，山东 威海 264300)

白屈菜红碱属于异喹琳类苯并菲啶型生物碱，可从白屈菜、博落回、血水草、飞龙掌血等药材中获得[1]，具有抗肿瘤、消炎、改善肝功能、抑菌、抑制胆碱酯酶、镇痛、抗糖尿病等活性[2-4]，但该成分在水中的溶解度仅为58.46 μg/mL[5]，口服给药后半衰期短[6]，体内易被代谢[7-8]，口服生物利用度只有7.46%[8]，而且其固体分散体[5,9]稳定性可能存在问题，容易析晶。赵义军等[10]采用单硬脂酸甘油酯制备了固体脂质纳米粒，但该辅料可能会对人体器官有一定损伤作用[11]；柳阳等[12]制备了白屈菜红碱脂质体，但包封率不足80%，达不到2020年版《中国药典》对纳米制剂包封率的要求。

聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)是一种两亲性嵌段共聚物，在体内外通过主体降解(生成水溶性单体乳酸和羟基乙酸)、表面侵蚀等机理释放药物[13]，在纳米制剂领域中的应用较多[14-16]，可有效提高难溶性药物的溶解度、溶出度、生物利用度、药效等参数[17-20]。因此，本实验制备白屈菜红碱PLGA纳米粒，并考察其体内药动学，以期为相关新制剂的开发提供参考依据。

1 材料

BSA224S型电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]；Agilent 1100型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；TJTD-806型溶出仪(北京海富达科技有限公司)；Q-060S型超声仪(深圳市千雨超声波实业有限公司)；Master-sizer型粒度分析仪(英国马尔文仪器有限公司)；BDF-86型超低温冰箱(济南童鑫生物科技有限公司)；85-2A型磁力搅拌器(常州市亿能实验仪器厂)；89-TH型真空冻干机(上海争巧科学仪器有限公司)；XD-200A型旋转蒸发仪(上海贤德实验仪器公司)。

白屈菜红碱对照品(批号110807-201806，纯度98.4%，中国食品药品检定研究院)；白屈菜红碱原料药(批号180428，纯度98%，湖北广奥生物科技有限公司)。聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA，LA∶GA=50∶50，分子量38 000 Da，东莞市豪圣塑胶原料有限公司)；甘露醇(批号201025，湖南九典制药股份有限公司)；泊洛沙姆188(批号P20200610，武汉兴起点生物科技有限公司)。

SD大鼠，体质量200～240 g，购于青岛市动物实验中心，动物生产许可证号SCXK(LU)2018-0007，在实验室适应1周后进行药动学研究。

2 方法与结果

2.1 白屈菜红碱含量测定

2.1.1 色谱条件 Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相甲醇-0.05 mol/L KH2PO4(35∶65)；体积流量1.0 mL/min；温度30 ℃；检测波长282 nm。

2.1.2 供试品溶液制备 取1 mL PLGA纳米粒混悬液，置于50 mL量瓶中，加入3 mL丙酮超声处理5 min，甲醇定容，量取2 mL至10 mL量瓶中，流动相定容，即得。

2.1.3 线性关系考察 取白屈菜红碱对照品约10 mg，精密称定，甲醇稀释成每1 mL约含0.2 mg该成分的贮备液，流动相依次稀释至10、5、2、1、0.5、0.05 μg/mL，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定。以对照品峰面积(Y)对其质量浓度(X)进行回归，得方程为Y=15.078 9X-0.061 43(r=0.999 4)，在0.05～10 μg/mL范围内线性关系良好。

2.1.4 方法学考察 取供试品溶液适量，于 0、3、6、9、12、24 h在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得白屈菜红碱含量RSD为0.63%，表明溶液在24 h内稳定性良好。制备6份供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得白屈菜红碱含量RSD为1.55%，表明该方法重复性良好。取0.05、2、10 μg/mL对照品溶液，同一天内在“2.1.1”项色谱条件下各进样测定6次，测得日内精密度RSD分别为0.64%、0.38%、0.76%；同法连续测定6 d，每天1次，测得日间精密度RSD分别为0.95%、0.38%、0.71%，表明该方法精密度良好。取9份PLGA纳米粒混悬液，每份0.5 mL，每3份为1组，共3组，分别加入贮备液0.75 mL(低)、1.25 mL(中)、1.75 mL(高)，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得白屈菜红碱平均加样回收率分别为101.54%、99.48%、100.77%，RSD分别为1.04%、0.68%、0.81%。

2.2 PLGA纳米粒制备[13]取30 mg白屈菜红碱原料药、处方量PLGA，溶于15 mL丙酮中，超声溶解，作为有机相，逐滴加到60 mL含一定浓度泊洛沙姆188的水相中(磁力搅拌，转速800 r/min)，超声处理后减压旋蒸除去有机溶剂，置于-15 ℃冰箱中10 min，过0.45 μm微孔滤膜，蒸馏水补足至60 mL，即得。

2.3 指标测定 取PLGA纳米粒混悬液适量，蒸馏水稀释30倍，混匀，取适量于粒度分析仪上测定粒径、Zeta电位。取1 mL纳米粒混悬液至超滤管(截留分子量10 000 Da)中，8 000 r/min离心30 min，测定续滤液中游离白屈菜红碱量(m1)；按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，测定白屈菜红碱总量(m2)，计算包封率、载药量，公式分别为包封率=[(m2-m1)/m2]×100%、载药量=[(m2-m1)/m总]×100%，其中m总为PLGA载体、白屈菜红碱总量。

2.4 制备工艺优化 采用单因素试验。

2.4.1 表面活性剂种类 固定白屈菜红碱用量为30 mg，PLGA用量为300 mg，表面活性剂浓度为1%，超声功率为250 W，超声时间为10 min，考察吐温-80、聚乙烯醇、F68对包封率、载药量、粒径的影响，结果见表1。由此可知，加入吐温-80后，包封率、载药量较低，粒径较大；加入聚乙烯醇后，包封率、载药量最高，但它具有一定毒性[16]，可能会影响制剂安全性；F68安全性较好，虽然包封率、载药量略低于加入聚乙烯醇后，但粒径最小。因此，最优表面活性剂为F68。

表1 表面活性剂种类对包封率、载药量、粒径的影响(n=3)

2.4.2 PLGA用量 固定白屈菜红碱用量为30 mg，F68浓度为1%，超声功率为250 W，超声时间为10 min，考察PLGA用量100、200、300、400、500 mg对包封率、载药量、粒径的影响，结果见表2。由此可知，随着PLGA用量增加，包封率升高，在500 mg时无明显变化，但载药量显著降低，粒径显著升高，可能是由于其用量过大时体系黏度增加，不利于纳米分散所致。因此，最优PLGA用量为400 mg。

表2 PLGA用量对包封率、载药量、粒径的影响(n=3)

2.4.3 表面活性剂浓度 固定白屈菜红碱用量为30 mg，PLGA用量为400 mg，超声功率为250 W，超声时间为10 min，考察F68浓度0.3%、0.5%、0.8%、1.0%、1.3%、1.5%对包封率、载药量、粒径的影响，结果见表3。由此可知，F68浓度小于1.0%时，包封率、载药量显著降低，可能是因为浓度过低时影响乳化效果，未能有效包裹药物，但浓度过高时又会导致体系黏度升高，影响PLGA载体包裹药物，这与F68增溶作用有关；F68浓度小于1.0%时粒径显著增加，但大于1.0%时无明显变化。因此，最优表面活性剂浓度为1%。

表3 表面活性剂浓度对包封率、载药量、粒径的影响(n=3)

2.4.4 超声功率 固定白屈菜红碱用量为30 mg，PLGA用量为400 mg，F68浓度为1%，超声时间为10 min，考察超声功率150、200、250、300、350 W对包封率、载药量、粒径的影响，结果见表4。由此可知，超声功率为350 W时，包封率、载药量显著降低，但粒径无明显变化；为300 W时，粒径显著低于250 W时。因此，最优超声功率为300 W。

表4 超声功率对包封率、载药量、粒径的影响(n=3)

2.4.5 超声时间 固定白屈菜红碱用量为30 mg，PLGA用量为400 mg，F68浓度为1%，超声功率为300 W，考察超声时间6、8、10、12、15 min对包封率、载药量、粒径的影响，结果见表5。由此可知，超声时间为15 min时，体系温度较高，对PLGA纳米粒有一定破坏作用，而且粒径增大；为12 min时，包封率、载药量均显著高于10、15 min时，同时粒径显著小于15 min时。因此，最优超声时间为12 min。

表5 超声时间对包封率、载药量、粒径的影响(n=3)

2.5 验证试验 按“2.4”项下优化工艺平行制备3批PLGA纳米粒，测得平均包封率为(83.71±1.73)%，载药量为(5.76±0.27)%，粒径为(231.82±15.73)nm(图1)，PDI为0.101±0.014，Zeta电位为(-17.11±1.94)mV(图2)。

2.6 冻干粉制备 由于PLGA纳米粒Zeta电位绝对值较低，可能会影响其储存稳定性，故进一步将其制成冻干粉。选择6%甘露醇作为冻干保护剂，将PLGA纳米粒置于-45 ℃超低温冰箱中预冻2 d，再放到初始温度为-35 ℃的冷冻干燥机中抽真空24 h，取出粉末，立即密封，迅速置于干燥器中保存，测定复溶后其平均粒径为(284.71±18.66)nm，PDI为0.173±0.019，Zeta电位为(-13.58±1.69)mV。

2.7 晶型分析 取原料药、空白辅料(比例同PLGA纳米粒冻干粉)、物理混合物(原料药、空白辅料用量比例同PLGA纳米粒冻干粉)、PLGA纳米粒冻干粉适量，进行XRPD扫描，设定速度为6°/min，2θ范围为3°～52°，结果见图3。由此可知，原料药在5.7°、10.8°、11.6°、14.9°、15.3°、20.4°、22.6°、24.3°处出现衍射峰；空白辅料也出现大量衍射峰，有些强度远大于原料药；物理混合物在5.7°、10.8°、11.6°处仍可发现原料药特征衍射峰；PLGA纳米粒冻干粉未见原料药特征衍射峰，表明后者转变为无定形状态。

2.8 溶解度测定 取过量原料药、物理混合物、PLGA纳米粒冻干粉各3份，加入适量蒸馏水，置于37 ℃恒温振荡箱中振荡3 d，取上层混悬液，过0.22 μm水相膜，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，计算溶解度。结果，原料药、物理混合物平均溶解度分别为58.46、62.93 μg/mL，而PLGA纳米粒冻干粉达783.08 μg/mL，是原料药的13.4倍。

2.9 体外溶出研究 取原料药、PLGA纳米粒冻干粉(均含15 mg白屈菜红碱)，加入5 mL蒸馏水，置于透析袋中，以900 mL蒸馏水为释药介质，设定温度为(37±1)℃，转速为100 r/min，于设定时间点各取样2 mL，同时补加2 mL蒸馏水，过0.22 μm水相膜，计算累积溶出度，结果见图4。由此可知，原料药在24、48、72 h内累积溶出度分别为31.24%、36.76%、43.19%，而PLGA纳米粒分别达66.04%、74.83%、81.07%。

2.10 体内药动学研究

2.10.1 分组、给药与采血 采用0.5%CMC-Na溶液制备原料药、PLGA纳米粒灌胃液，质量浓度均为3 mg/mL。将禁食过夜的12只大鼠随机分为2组，每组6只，均以15 mg/kg剂量灌胃给药(结束后均用1 mL蒸馏水冲洗灌胃针，并注入胃内)，其中原料药组于0.167、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、10、12 h采血，PLGA纳米粒组于0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、8、10、12 h采血，均取0.2～0.3 mL，置于肝素浸润离心管中，振荡混匀，3 000 r/min离心3 min，移取上层血浆，冷冻保存。

2.10.2 血浆处理 参考文献[3,6]报道，血浆室温解冻，量取100 μL至离心管中，加入内标溶液(取盐酸小檗碱对照品适量，甲醇制成600 ng/mL，即得)50 μL、甲醇200 μL，涡旋3 min得混悬液，加入1 mL氯仿，涡旋振荡3 min，8 000 r/min离心5 min，取上清液，40 ℃ N2吹干，加入甲醇100 μL，振荡复溶，进样分析。

2.10.3 线性关系考察 将对照品溶液用甲醇依次稀释至1 800、900、450、200、100、20 ng/mL，分别精密量取100 μL至离心管中，40 ℃ N2吹干，加入空白血浆100 μL，涡旋3 min后加入50 μL内标溶液，作为血浆对照品溶液，按“2.10.2”项下方法处理，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定。以对照品、内标峰面积比值为纵坐标(Y)，对照品质量浓度为横坐标(X)进行回归，得方程为Y=0.029 4X-0.411 8(r=0.991 7)，在20～1 800 ng/mL范围内线性关系良好。

2.10.4 方法学考察 取空白血浆、血浆对照品溶液(20 ng/mL)、给药12 h后血浆适量，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，结果见图5，可知对照品、内标均不受血浆内源性物质干扰，表明该方法专属性良好。取血浆样品溶液适量，于0、3、6、9、12、24 h在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得对照品、内标峰面积比值RSD为8.06%，表明样品在24 h内稳定性良好。取20、450、1 800 ng/mL血浆对照品溶液适量，在“2.1.1”项色谱条件下各进样测定6次，测得对照品、内标峰面积比值RSD分别为3.66%、6.17%、4.23%，表明仪器精密度良好。取20、450、1 800 ng/mL对照品溶液各100 μL，加入50 μL内标溶液，40 ℃ N2吹干，加入100 μL空白血浆，按“2.10.2”项下方法操作处理，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，并与实测值进行对比，测得白屈菜红碱平均加样回收率分别为91.94%、96.41%、93.07%。

2.10.5 结果分析 血药浓度-时间曲线见图6，主要药动学参数见表6。由此可知，与原料药比较，PLGA纳米粒tmax、t1/2延长(P<0.01)，Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高(P<0.01)，生物利用度增加至4.08倍。

表6 白屈菜红碱主要药动学参数

3 讨论

本实验在制备供试品溶液过程中发现，甲醇定容时白屈菜红碱色谱峰对称性差，而流动相定容时较好，可能是由于流动相可有效消除溶剂效应所致。结果显示，PLGA纳米粒将白屈菜红碱溶解度提高至13.4倍，可能与该成分表面积增大、处方中表面活性剂增溶、存在状态改变等因素有关[19-20]；在各个时间点的累积溶出度均高于原料药，其原因除了与白屈菜红碱溶解度提高有关外，还可能是药物释放使得纳米结构存在间隙，加大PLGA与介质之间的接触面积，从而加速该剂型降解及药物释放[21]。同时，白屈菜红碱PLGA纳米粒tmax显著延长，可能与载体材料缓释作用有关[22]，处方中泊洛沙姆188可减缓胃肠道蠕动[23]，增加药物胃肠道滞留时间，从而影响入血速度；相对生物利用度提高至4.08倍，可能是由于该剂型可提高白屈菜红碱溶解度、溶出度，从而解决了药物吸收瓶颈。

另外，PLGA纳米粒载体的包裹作用可减少胃肠道各种酶代谢、pH值等对白屈菜红碱稳定性的影响[20,23-24]，该成分以无定型状态存在，比晶型药物更易吸收[25-26]，并且该剂型可有效促进药物透过黏液层与细胞层进入血液循环[16]，从而提高口服吸收生物利用度。今后，可对白屈菜红碱PLGA纳米粒的注射药动学、抗肿瘤作用等方面作进一步探索。