人参皂苷Re-β-环糊精包合物的制备及其体内药动学研究

章国磊， 姜星宇， 王 伟， 陆勃帆， 李世男， 焦丽丽， 李 慧*， 吴 巍*

(1.长春中医药大学，吉林省人参科学研究院，吉林 长春 130117；2.长春金赛药业有限责任公司，吉林 长春 130012)

人参皂苷Re是人参三醇型皂苷的主要成员[1]，具有提高记忆力[2]、促进脂质代谢[3]、改善心血管[4]、抗衰老[5]、抗疲劳[6]等药理活性。但该成分溶解度较差，生物利用度很低，导致其临床应用受限[7]。

近年来，环糊精包合技术在提高疏水性药物溶解性、化学稳定性、生物利用度方面取得了较好效果[8-9]，其中β-环糊精作为难溶性药物分子的包合材料，因其低生物毒性、高生物相容性而备受关注[10-13]，但尚无应用于包合人参皂苷Re的报道。因此，本实验制备人参皂苷Re-β-环糊精包合物，并考察其体内药动学，以期为改善该成分吸收、增加其临床应用提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；Nicolet iS5傅里叶变换红外光谱仪(美国Thermo公司)；TA-Q20差示量热扫描仪(美国TA公司)；TD3500 X射线衍射仪(丹东通达科技有限公司)；JSM-IT100扫描电子显微镜(日本电子株式会社)；HAC-I自动氮吹浓缩仪(天津市恒奥科技发展有限公司)；Ultimate3000型液相色谱系统、TSQ Endura三重四极杆质谱仪(美国Thermo公司)；AG 22331低温高速离心机(德国Eppendorf 公司)；SQP电子分析天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]。

1.2 试剂与药物 对照品人参皂苷Re(批号B10M8S35243，上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98%)、人参皂苷Rf(批号52286-58-5，上海宝曼生物科技有限公司，纯度≥98%)。β-环糊精(批号C10575901，上海麦克林生化科技有限公司，纯度>98%)。甲酸、乙腈为色谱纯(美国Thermo Fisher Scientific公司)；其他试剂均为分析纯；水为双蒸水。

1.3 动物 SD大鼠，雄性，体质量200～220 g，购自中国长春亿斯实验动物技术有限公司，许可证号XS191227014037，动物福利和实验由长春中医药大学动物保健与使用委员会批准。

2 方法与结果

2.1 相溶解度测定 基于Higuchi、Connors[14]报道的方法，将过量人参皂苷Re加到2 mL不同浓度(0～30 mmol/L)β-环糊精溶液中搅拌混匀，充入氮气后密封以防止药物氧化，将混悬液在25 ℃下搅拌168 h，达到平衡后4 000 r/min离心10 min，除去多余的人参皂苷Re，滤液过0.22 μm微孔滤膜，适当稀释后采用HPLC法[15]测定人参皂苷Re含量。以β-环糊精浓度为横坐标(X)，人参皂苷Re在不同浓度β-环糊精溶液中的溶解度为纵坐标(Y)绘制相溶解度曲线，计算表观稳定常数(Ks)，公式为Ks=Slope/S0(1-Slope)，其中Slope为曲线斜率，S0为在没有β-环糊精时人参皂苷Re溶解度。其他热力学参数可通过温度和稳定常数计算得到，如吉布斯自由能(ΔG)，公式为ΔG=-RTlnKs，其中R为通用气体常数[8.314 J/(mol·K)]，T为开尔文温度。

结果，相溶解度曲线为Y=0.002 7X+0.105 4(R2=0.997 0)，表明人参皂苷Re溶解度随着β-环糊精浓度增加而线性升高，根据相溶解度图分类方法，可将其归为AL型，即包合物是由人参皂苷Re与β-环糊精按1∶1比例结合所得。另外，S0(×10-3mol/L)为0.403，Slope为0.189，Ks(×10-3mol/L)为0.631，ΔG为-16.837 5 kJ/mol<0，表明包合在常温常压下溶液中可能是自发进行的。

2.2 包合物、物理混合物制备

2.2.1 包合物 按1∶1比例精密称取β-环糊精、人参皂苷Re适量，将前者置于磨口锥形瓶中，加入150倍量水，水浴加热搅拌使其充分溶解；后者加入适量无水乙醇使其完全溶解，缓慢滴加至前者溶液中，在30 ℃下搅拌4 h，60 ℃旋转蒸发除去溶剂，滤液在-80 ℃下冷冻12 h，置于冻干机中冷冻至完全干燥，即得(性状为白色固体粉末)。

2.2.2 物理混合物 按1∶1比例精密称取β-环糊精、人参皂苷Re适量，搅拌混匀，即得。

2.3 溶解度测定 精密称取过量人参皂苷Re及其β-环糊精包合物，置于10 mL棕色量瓶中，蒸馏水溶解并定容至刻度，制成过饱和溶液，35 ℃、100 r/min离心，微孔滤膜过滤，取续滤液，HPLC法[15]测定人参皂苷Re含量，计算溶解度。结果，人参皂苷Re及其β-环糊精包合物的溶解度分别为0.35、3.54 mg/mL，后者是前者的10.11倍。

2.4 溶出度测定 精密称取原料药、物理混合物、β-环糊精包合物各6份(均含20 mg人参皂苷Re)，置于(37±0.5)℃恒温的200 mL去离子水中，设定转速为100 r/min。采用转篮法，当药物接触到介质时于5、15、30、45、60 min用取样针各取样1.0 mL，同时补加1.0 mL同温介质，0.22 μm水系微孔滤膜过滤，在203 nm波长处测定吸光度[15]，计算累积溶出度，绘制溶出曲线，结果见图1。由此可知，原料药溶出非常缓慢，60 min内累积溶出度仍小于20%；物理混合物累积溶出度略高于原料药；β-环糊精包合物溶出非常迅速，这可能是由于β-环糊精可显著减少人参皂苷Re与溶解介质之间的界面张力，从而提高前者溶出度和溶解度，并且在一定程度上也能改善其口服生物利用度[16-17]。

2.5 表征研究

2.5.1 傅立叶红外光谱(FT-IR) 取原料药、β-环糊精、物理混合物、β-环糊精包合物适量，与KBr混合研磨均匀后压片，采用傅里叶红外光谱仪在4 000～400 cm-1波数范围内进行分析，结果见图2。由此可知，原料药红外谱图中3 427.1 cm-1附近为-OH的伸缩振动峰，2 932.3、2 872.3 cm-1附近分别为-CH3、-CH2的伸缩振动峰，1 650.3 cm-1附近为-OH的弯曲振动峰，1 029.3 cm-1附近为C-O的伸缩振动峰；物理混合物红外谱图可看成是β-环糊精、人参皂苷Re红外谱图的叠加，-CH2的伸缩振动峰仍存在；β-环糊精包合物红外谱图中上述特征峰消失，与β-环糊精红外谱图非常接近，表明该制剂成功形成，同时没有出现新的吸收峰，表明原料药与β-环糊精包合物之间没有形成共价键，而是以非共价键形式结合。

2.5.2 X射线衍射(XRD) 取原料药、β-环糊精、物理混合物、β-环糊精包合物适量，在2θ0°～80°范围内进行分析，结果见图3。由此可知，原料药呈晶形结构，明显特征峰出现在9.58°处；β-环糊精也呈晶形结构，明显特征峰出现在13.26°处；物理混合物存在人参皂苷Re衍射峰、β-环糊精无定形结构，其图谱是由每个单一组分的光谱叠加组成，表明没有新结构形成；β-环糊精包合物峰型和强度与上述样品明显不同，呈光晕状的无定形状态，9.58°、13.26°处特征峰消失，原料药、β-环糊精的衍射峰晶形在包合前后发生显著变化，表明两者成功形成包合物。

2.5.3 差示扫描量热(DSC) 在DSC分析测定曲线中，当客体分子全部或部分包含在CD腔或晶格中时，其自身特征可能不同于自然结构，一般来说其融化、沸腾或升华点可转移到1个不同的温度或消失[18]。取原料药、β-环糊精、物理混合物、β-环糊精包合物适量，以氧化铝作为参考材料，在N2保护下以10 ℃/min扫描速率程序升温(20～300 ℃)，结果见图4。由此可知，原料药在95.8、112.8 ℃处分别有1个吸热峰；β-环糊精在93.0 ℃处有1个宽的吸热峰，可能是由于其所含水的释放所致；物理混合物仍存在原料药吸热峰；β-环糊精包合物中原料药吸热峰消失，在104.3 ℃处出现了1个新的吸热峰，表明原料药与β-环糊精成功形成包合物。

2.5.4 扫描电子显微镜(SEM) 取原料药、β-环糊精、物理混合物、β-环糊精包合物适量，对其形状和表面特征进行观察，结果见图5。由此可知，原料药呈块状晶体；β-环糊精呈碎片状晶体；物理混合物同时存在块状、碎片状晶体；β-环糊精包合物中原料药、β-环糊精形态消失，其物相结构明显不同于物理混合物，表明两者形成包合物后主客分子的原晶格排列发生变化，形成新物相。

2.6 药动学研究

2.6.1 药液制备 称取200 mg原料药，加到10 mL蒸馏水中，超声处理后充分混匀，制成20 mg/mL混悬液；称取500 mg β-环糊精包合物(原料药含量为40.07%)，加到10 mL蒸馏水中，超声处理后充分混匀，制成50 mg/mL混悬液。

2.6.2 分组、给药与采血 12只大鼠随机分为2组，每组6只，适应性饲养1周，给药前禁食不禁水12 h，分别一次性灌胃给予“2.6.1”项下2种药液，剂量均为100 mg/kg，于0.083、0.25、0.5、1、2、3、4、6、9、10、12、24 h眼眶静脉丛采血各约0.5 mL，置于肝素钠抗凝处理的1.5 mL离心管中，4 ℃、4 000 r/min离心10 min，分离得到上层血浆，在-80 ℃下保存。

2.6.3 HPLC-MS/MS分析条件

2.6.3.1 色谱 反相Accucore C18分析柱(100 mm×2.1 mm，2.6 μm)；流动相0.1%甲酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～5.0 min，25%～30%B；5.0～8.0 min，30%～32%B；8.0～9.0 min，32%～36%B；9.0～16.0 min，36%～37%B；16.0～16.8 min，37%～48%B；16.8～17.8 min，48%～70%B；17.8～18.8 min，70%～90%B；18.8～20.8 min，90%～25%B；20.8～25 min，25%B)；体积流量0.2 mL/min；柱温30 ℃；自动进样器温度4 ℃；进样量5 μL。

2.6.3.2 质谱 电喷雾离子源(ESI)，负离子多级反应监测模式(MRM)；喷雾电压3 kV；毛细管温度325 ℃；雾化器温度275 ℃；鞘气、辅助气压力30、10 arb；人参皂苷Re、人参皂苷Rf均采用[M+HCOO]-离子进行多级反应监测(MRM)，前者m/z991.5～945.5，945.5～637.3，637.3～475.3；后者m/z845.48～799.31, 799.31～637.3，637.3～475.3；碰撞能量55、45 eV。

2.6.4 对照品、内标溶液制备 精密称取人参皂苷Re对照品5.00 mg，5 mL 80%甲醇制成1 mg/mL对照品溶液；同法将人参皂苷Rf对照品制成10 ng/mL内标溶液，在4 ℃下保存。

2.6.5 血浆处理 精密移取血浆0.1 mL、内标溶液20 μL、50%甲醇80 μL，加入0.5 mL甲醇-乙腈(60∶40)混合溶液进行蛋白沉淀，涡旋振荡3 min，12 000 r/min离心10 min，分离出上清液，40 ℃氮气流蒸干，残余物用0.2 mL 80%甲醇溶解，过0.22 μm有机滤膜，进行HPLC-MS/MS分析(进样量5 μL)，内标法计算人参皂苷Re血药浓度。

2.6.6 线性关系考察 分别将对照品、内标溶液加到空白血浆中，制备血浆对照品、内标溶液，两者质量浓度分别为0.05～100、1 ng/mL，按“2.6.5”项下方法处理，在“2.6.3”项条件下进样测定。以对照品、内标峰面积比值为横坐标(X)，对照品质量浓度为纵坐标(Y)进行回归，得方程为Y=0.233 4X+1.564 5(R2=0.993 6)，在0.05～100 ng/mL范围内线性关系良好。同时，信噪比(S/N)≥3时检测限为0.001 6 ng/mL，S/N≥10时定量限为0.005 3 ng/mL。

2.6.7 专属性、基质效应考察 取空白血浆、血浆质控样品(含0.05 ng/mL人参皂苷Re)、给药24 h后血浆适量，按“2.6.5”项下方法处理，在“2.6.3”项条件下进样测定，结果见图6。由此可知，对照品、内标分离度良好，内源性血浆物质无明显干扰。取低、中、高质量浓度(0.05、10、100 ng/mL)血浆质控样品适量，按“2.6.5”项下方法处理，在“2.6.3”项条件下进样测定，同法分析含内标的相同质量浓度对照品溶液和内标溶液，测得人参皂苷Re基质效应分别为103.69%、98.45%、95.07%，内标基质效应分别为95.26%、96.33%、94.81%，表明该方法具有较好的专属性，可有效避免基质效应对测定结果的影响。

2.6.8 精密度、准确度、提取回收率、稳定性试验 按“2.6.6”项下方法制备低、中、高质量浓度(0.05、10、100 ng/mL)对照品溶液及含1 ng/mL内标的血浆质控样品溶液，按“2.6.5”项下方法处理，同一天内在“2.6.3”项条件下进样测定6次，计算日内精密度；同法连续测定3 d，每天1次，计算日间精密度，测得前者RSD分别为6.72%、4.16%、8.36%，后者RSD分别为 8.03%、5.69%、9.10%，表明该方法精密度良好。准确度用相对方法回收率表示，测得日内准确度分别为104.01%、107.80%、104.32%，日间准确度分别为106.71%、105.18%、91.37%，表明该方法准确度良好。取上述质量浓度血浆质控样品溶液各0.1 mL，按“2.6.5”项下方法处理，在“2.6.3”项条件下进样测定，同时取0.1 mL相同来源的空白血浆，按“2.6.5”项下方法处理，加入与血浆质控样品相同质量浓度的对照品溶液和内标溶液，在“2.6.3”项条件下进样测定，计算提取回收率，公式为提取回收率=(C/S)×100%，其中C为血浆质控样品溶液中人参皂苷Re峰面积，S为对照品溶液中人参皂苷Re峰面积，结果分别为91.24%、94.16%、95.18%。取上述3个质量浓度的血浆质控样品溶液适量，分别在4 ℃下保存24 h、-20 ℃下进行3次冻融循环、-80 ℃下保存30 d，按“2.6.5”项下方法处理，在“2.6.3”项条件下进样测定，测得人参皂苷Re峰面积RSD分别为4.65%、5.11%、8.35%，表明样品在上述条件下均具有良好的稳定性。

2.7 结果分析 大鼠灌胃给药后，绘制血药浓度-时间曲线，见图7，再采用Phoenix WinNonlin 8.1药动软件(美国Pharsight 公司)中的非房室模型统计矩方法计算主要药动学参数，结果见表1。由此可知，与原料药比较，β-环糊精包合物Cmax、AUC0～24 h、AUC0～∞升高(P<0.05)，CLt、Vdss降低(P<0.05)，T1/2、MRT延长(P<0.05)，Tmax缩短(P<0.05)，相对生物利用度为191.01%。

表1 人参皂苷Re主要药动学参数

3 讨论

本实验将水溶性较差的人参皂苷Re与β-环糊精制成包合物，通过FT-IR、XRD、DSC表征发现，包合后该成分热性质、晶体形貌等参数发生明显变化，表明包合物成功形成。再建立HPLC-MS/MS法测定人参皂苷Re血药浓度，发现包合物可增加Cmax，缩短Tmax，提高相对生物利用度，其原因可能是由于β-环糊精含有多个亲水性的醇羟基，使包合物具有良好的可湿润性，在水中的溶解度得到改善，药物分子更易通过生物细胞膜和血脑屏障[19]；包合物体内半衰期延长，可能是由于包合作用使人参皂苷Re溶解性增加，从而加速药物吸收，提高血药浓度，导致机体清除时间延长。

研究表明，β-环糊精及其衍生物可耗竭细胞膜上胆固醇，改变其结构、通透性，从而抑制与口服药物生物利用度密切相关的P-糖蛋白活性[20]，使药物进入肠上皮细胞的机率、进入肝肠循环的药物增加，导致MRT、T1/2延长。本实验发现，包合物药动学曲线消除相上有峰波动，可能是由于肠胃循环中人参皂苷Re在胃肠道不同位置吸收速率的差异所致[21]。除此之外，肠肝循环也是重要原因之一，并受某些酶的水解作用或重吸收过程中胆汁间歇性释放的影响，导致产生2个或多个峰，并且药物由于分布于肾脏、心脏、肝脏，其再分配效应也可能会造成多峰现象[22]，这对人参皂苷Re相关剂型的开发具有重要参考意义。