荆防颗粒质量评价

姚世霞， 刘东升， 牛钰婷， 朱旭江， 刘志浩， 朱 琳

(甘肃省药品检验研究院，国家药品监督管理局中药材饮片质量控制重点实验室，甘肃 兰州 730070)

荆防颗粒由荆芥、防风、柴胡、川芎、羌活、独活、前胡等11味药材组成，具有发汗解表、散风祛湿的功效[1]，来源于《摄生众妙方》中的荆防败毒散[2]，方中荆芥、防风，散风解表，为君药；羌活、独活散风去湿，柴胡升清透表，川芎行血祛风，共为臣药；桔梗、枳壳、前胡、茯苓分别有开肺、降气、祛痰、渗湿之效，共为佐药；甘草和中调药，兼助益气，为使药[3-5]。新冠肺炎疫情发生以来，荆防败毒散及其同方制剂荆防颗粒多地列入推荐群体性预防和治疗的药物[6-9]，该制剂现行标准收载于《卫生部药品标准第二册》，但仅有性状与常规检查项，不能满足其质量控制要求。因此，本实验建立HPLC法同时测定荆防颗粒中升麻素苷、亥茅酚苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、紫花前胡苷、蛇床子素、白花前胡甲素含量，并采用聚类分析、主成分分析对7家厂家88批样品进行考察，以期为该制剂质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器 Waters e2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)；ME204(万分之一)、MS205DU(十万分之一)电子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；HH-6数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)。

1.2 试剂与药物 升麻素苷(批号111522-201712，纯度96.2%)、橙皮苷(批号110721-201617，纯度96.1%)、紫花前胡苷(批号110821-201604，纯度99.6%)、柚皮苷(10722-201815，纯度91.7%)、新橙皮苷(批号111857-201804，纯度99.4%)、蛇床子素(批号110822-201710，纯度99.5%)、白花前胡甲素(批号111711-201904，纯度99.4%)对照品(中国药品食品检定研究院)；芸香柚皮苷对照品(批号P29M6R4，纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司)；亥茅酚苷对照品(批号DST200306，纯度≥98%，成都德思特生物技术有限公司)。荆防颗粒共88批，来自2020年国家评价性抽样，涉及7家厂家。乙腈为色谱纯(德国默克公司)；其他试剂均为分析纯；水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 CAPCELL PAK C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱(0～4 min，10%A；4～20 min，10%～16%A；20～30 min，16%～20%A；30～45 min，20%～40%A；45～58 min，40%～80%A；58～73 min，80%A)；体积流量1 mL/min；柱温30 ℃；检测波长254 nm(升麻素苷、亥茅酚苷)、280 nm(芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷)、320 nm(紫花前胡苷、蛇床子素、白花前胡甲素)。

2.2 对照品溶液制备 精密称取对照品升麻素苷21.44 mg、亥茅酚苷14.26 mg、芸香柚皮苷9.14 mg、柚皮苷23.72 mg、新橙皮苷17.06 mg、橙皮苷19.25 mg、紫花前胡苷14.99 mg、蛇床子素19.34 mg、白花前胡甲素14.11 mg，甲醇溶解，即得(质量浓度分别为8.25、11.41、35.83、87.00、37.02、67.83、7.70、59.72、11.22 μg/mL)。

2.3 供试品溶液制备 取本品适量，研细，精密称取10 g，置于带塞锥形瓶中，加入25 mL甲醇，称定质量，80 ℃水浴回流提取2 h，晾至室温，甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得。

2.4 阴性样品溶液制备 按处方比例和工艺分别制备不含防风、前胡、羌活、独活、枳实的阴性样品，按“2.3”项下方法制备，即得。

2.5 系统适应性试验及专属性考察 取对照品、供试品、阴性样品溶液各10 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1～3。由此可知，供试品溶液中显示出与对照品溶液中对应成分保留时间相同的色谱峰，分离度良好，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

2.6 线性关系考察 精密吸取1、2、5、10、15、20、30 μL对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以进样量为横坐标(X)，峰面积积分值为纵坐标(Y)进行回归，再以信噪比(S/N)3∶1为检出限，10∶1为定量限，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系

2.7 精密度试验 取对照品溶液10 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得升麻素苷、亥茅酚苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、紫花前胡苷、蛇床子素、白花前胡甲素峰面积RSD分别为1.4%、1.3%、0.6%、0.8%、1.3%、0.5%、0.7%、1.8%、1.7%，表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验 取同一份供试品溶液，于0、4、8、12、16、20、24 h在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得升麻素苷、亥茅酚苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、紫花前胡苷、蛇床子素、白花前胡甲素峰面积RSD分别为0.8%、1.3%、0.6%、1.4%、0.9%、1.2%、1.3%、0.9%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.9 重复性试验 取本品(厂家C，批号0011901012)适量，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得升麻素苷、亥茅酚苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、紫花前胡苷、蛇床子素、白花前胡甲素含量RSD分别为3.1%、3.3%、1.5%、1.7%、1.9%、1.5%、2.8%、3.2%、3.3%，表明该方法重复性良好。

2.10 加样回收率试验 取本品(厂家C，批号0011901012)适量，置于锥形瓶中，分别按50%、100%、150%水平精密加入对照品溶液各3份，共9份，氮气吹干溶剂，精密加入本品5 g，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，升麻素苷、亥茅酚苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、紫花前胡苷、蛇床子素、白花前胡甲素平均加样回收率分别为92.9%、91.5%、92.4%、94.5%、94.0%、96.5%、92.1%、93.4%、92.9%，RSD分别为1.9%、1.7%、2.1%、1.8%、1.4%、1.1%、3.0%、2.8%、2.3%。

2.11 样品含量测定 取不同厂家、批次样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表2。

表2 各成分含量测定结果

2.12 化学计量学研究

2.12.1 聚类分析 采用SPSS 23.0软件对表2结果进行聚类分析，以平均欧式距离为标准，转换值标准化选择Z得分，结果见图4。由此可知，各厂家聚为3类，B、D、E为1类，A、C聚为1类，F、G为1类。

2.12.2 主成分分析 采用SPSS 23.0软件进行主成分分析，发现前2个主成分特征值均大于1，累积方差贡献率达89.11%，故以其代替9个变量，结果见表3、图5。由此可知，亥茅酚苷、白花前胡甲素、紫花前胡苷、蛇床子素、升麻素苷、芸香柚皮苷、橙皮苷含量在第一主成分中的载荷值较高，蛇床子素、升麻素苷、芸香柚皮苷、新橙皮苷、柚皮苷、橙皮苷含量在第二主成分中的载荷值较高，以各成分因子得分乘以对应特征值的算术平方根为主成分得分F1、F2，以其方差贡献率占累积方差贡献率的比例为权重，计算综合得分F，公式为F=(49.924F1+39.184F2)/89.108。结果，不同厂家样品综合得分依次为F>G>C>A>D、B、E(后三者得分接近)，与聚类分析结果一致。

表3 总方差解释

2.12.3 偏最小二乘法判别分析(PLS-DA) 将表2结果导入SIMCA 14.1软件，建立PLS-DA模型[10]，结果见图6，可知数据矩阵的结实率参数R2X为0.99，模型区分参数R2Y为0.79，模型预测参数Q2为0.76，均大于0.50，表明模型稳定性、预测性均较好。再提取9个变量的重要性投影值(VIP)，见图7，以VIP>1为标准，得到质量差异标志物为柚皮苷、新橙皮苷、紫花前胡苷、芸香柚皮苷。

3 讨论

3.1 样品提取方法选择 在2020年版《中国药典》一部中，防风、前胡、羌活、独活、枳实均以甲醇为提取溶剂。本实验分别对超声、回流提取进行考察，发现回流后各成分纯度高于超声后，并且在2 h时保持稳定。最终确定，样品提取方法为50 mL甲醇回流2 h。

3.2 检测波长选择 本实验发现，各成分紫外最大吸收波长分别为升麻素苷250、296 nm，亥茅酚苷299 nm，芸香柚皮苷282 nm，柚皮苷282 nm，橙皮苷282 nm，新橙皮苷283 nm，紫花前胡苷334 nm，蛇床子素320 nm，白花前胡甲素321 nm。综合考虑，确定检测波长分别为升麻素苷、亥茅酚苷254 nm，柚皮苷、芸香柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷280 nm，紫花前胡苷、蛇床子素、白花前胡甲素320 nm。

3.3 指标成分确定 荆防颗粒中枳壳含有芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷[11]，防风含有升麻素苷、亥茅酚苷[12]，前胡、羌活含有紫花前胡苷、白花前胡甲素[13-14]，独活含有蛇床子素[15]。因此，本实验选择上述成分作为指标。

4 结论

随着荆防颗粒在治疗新冠肺炎中的应用越来越广泛[16-18]，加强该制剂质量控制刻不容缓。本实验建立HPLC法同时测定荆防颗粒中升麻素苷、亥茅酚苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、紫花前胡苷、蛇床子素、白花前胡甲素的含量，该方法专属性强，重复性、准确性良好，稳定可靠，可为相关生产厂家加强质量控制和优化生产工艺提供参考。