牛病毒性腹泻/黏膜病(1型+2型)、牛传染性鼻气管炎、牛副流感(3型)三联灭活疫苗(E2蛋白+C1株+HB01株)的研制与免疫效果评价

赵 卓，胡义彬，雷莉辉，武沛泽，武春霞，马 岩，张巨峰，王 力，江厚生*

(1.北京生泰尔科技股份有限公司，北京 102600；2.北京华夏兴洋生物科技有限公司，北京 102600；3.北京农业职业学院，北京 102442)

牛病毒性腹泻/黏膜病是由牛病毒性腹泻/黏膜病病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)引起的传染病，急性死亡病例剖检以消化道黏膜发炎、糜烂和肠壁淋巴组织坏死为特点，主要表现为发热、咳嗽、流涎、腹泻和消瘦，白细胞明显减少。本病的感染率很高，但一般不表现临床症状，发病率约5%，以6～18个月龄居多，病死率为90%～100%[1]。本病常年均可发生，感染动物包括牛、羊、猪等，各种年龄的牛均易感，幼龄牛易感性最高[2]。

牛副流感是由牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type-3，BPIV3)引起的传染病，是引起幼年和成年牛呼吸道疾病的重要病原。临床感染牛的症状表现变化很大，从无症状感染到严重的呼吸道疾病。大部分感染BPIV3的牛仅表现咳嗽、发热等症状，而存在应激的牛则表现严重的组织损伤和免疫抑制，导致细菌继发感染，表现为严重的肺部和胸腔出血性败血症，且常混合牛呼吸道其它病毒的感染，使病情加重。近几年，在黑龙江、辽宁、新疆、云南、贵州、广西、河北、山东、河南、江西、湖南、福建等地均有牛感染BPIV3的报道，表明该病已经在我国部分省市呈现地区性流行，有调查研究结果显示牛场总体阳性率为50%以上[3-4]。

牛传染性鼻气管炎是由牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)引起牛的一种急性接触性传染病，可感染不同物种，包括牛、山羊和绵羊[5]，以高热、呼吸困难、鼻炎和上呼吸道炎症为特征。该病在世界各地普遍存在，主要的经济损失在于延缓肥育牛的生长和增重，患病奶牛产乳量下降，继发流产，其流产率有时高达50%，急性发病期牛死亡率可达10%。文献报道我国大部分地区也存在该病的流行[6-7]。

控制本病的主要措施在于应用疫苗进行免疫预防接种。我国目前已有牛传染性鼻气管炎灭活疫苗和牛病毒性腹泻/黏膜病(1型)疫苗上市销售，但尚无牛病毒性腹泻/黏膜病2型、牛副流感3型相关疫苗产品上市。本研究开展了牛病毒性腹泻/黏膜病(1型+2型)、牛传染性鼻气管炎、牛副流感(3型)三联灭活疫苗的实验室制备和免疫效力评价研究。

1 材 料

1.1 种毒 IBRV C1株，批号：2020002；BPIV3 HB01株，批号20200211；重组表达BVDV2 E2蛋白杆状病毒，批号20200322，均由北京生泰尔科技股份有限公司提供。

1.2 细胞 MDBK细胞，液氮保存，购自中国兽医药品监察所菌种保藏中心；Sf9细胞和重组表达BVDV1 E2蛋白CHO细胞，由北京生泰尔科技股份有限公司提供。

1.3 试验动物 18～22 g小鼠10只，购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司；2～6月龄IBRV和BPIV3中和抗体≤1∶4、BVDV中和抗体≤1∶4、PCR检测IBRV、BPIV3、BVDV阴性的健康犊牛50头，购自河北省涿州市金瑞丰奶牛专业合作社。

1.4 试剂耗材 DMEM培养基，购自GBICO公司；CD CHO 011培养基，购自甘肃健顺生物科技有限公司；IB905昆虫细胞全悬浮培养基，购自浙江壹生科生物技术有限公司；胎牛血清，购自兰州民海生物工程有限公司；Taq聚合酶，购自宝生物工程(大连)有限公司；PCR引物，由上海生物工程技术有限公司合成；疫苗佐剂(605佐剂)，由北京生泰尔科技股份有限公司提供；微载体(cytodex1)，购自GE Healthcare公司；葡萄糖测定试剂盒，购自上海荣盛生物药业有限公司。

1.5 仪器设备 搅拌式生物反应器(5 L)、PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、96孔细胞培养板、CO2细胞培养箱、倒置生物显微镜，均由北京生泰尔科技股份有限公司提供。

2 方 法

2.1 细胞培养

2.1.1 MDBK细胞悬浮培养 称取20 g微载体，用PBS洗两遍后，加入500 mL PBS，121 ℃高压灭菌30 min。用前弃掉PBS，加入2 L DMEM培养基，进行预热。将消化好的细胞经计数后，接种3×108数量级的细胞至盛有微载体的生物反应器中，设定培养参数为转速40～60 r/min，温度37 ℃，pH值7.0～7.2，溶氧50%，氧气、二氧化碳、氮气和空气均设定0.2～0.6 MPa。每日取样观察细胞生长状态，根据细胞残糖量和溶氧曲线进行换液1～2次。

2.1.2 CHO细胞悬浮培养 将细胞种子悬液转移至摇瓶内，加入适量CD CHO 011培养基培养，当细胞密度达到7×106～8×106/mL时，采用生物反应器扩大培养，起始密度控制在0.8×106～1.2×106/mL，控制pH为7.0左右，转速100 r/min，培养22～24 h。

2.1.3 Sf9细胞悬浮培养 将摇瓶培养生长良好的Sf9细胞转移至生物反应器，加入新的培养液，将细胞密度调整至1×105/mL。维持体系溶氧(DO)25%～35%，26～28 ℃培养22～24 h。

2.2 制苗抗原制备

2.2.1 IBRV和BPIV3培养和灭活 待MDBK细胞铺满整个载体表面时，静置，弃去细胞生长液，加入适量的细胞维持液。将IBRV和BPIV3毒种用细胞维持液进行1∶100稀释后，再按细胞维持液加入量的1/100接种微载体悬浮培养的MDBK细胞，各项参数保持不变，培养72 h收获。收获的病毒培养产物冻融1～2次后，低速离心或过滤，除去微载体，收集培养液移至灭菌容器内，置-15 ℃以下保存。取样进行病毒含量测定和无菌检验，并将收获的IBRV和BPIV3抗原采用终浓度为0.2%的甲醛进行灭活。灭活完毕，分别取样进行无菌检验和灭活检验，检验合格后用于疫苗配制。

2.2.2 BVDV1 E2蛋白制备和灭活 当CHO细胞密度达到2×106～3×106/mL时进行流加培养，调节pH为7.00±0.05，DO为40%，进行蛋白的表达，在细胞活率降至50%时收获细胞培养液，离心收取上清，采用亲合树脂进行纯化后，取样进行蛋白纯度、浓度、琼扩效价检测，并采用BEI进行灭活。灭活完毕，取样进行无菌检验，检验合格后用于疫苗配制。

2.2.3 BVDV2 E2蛋白制备和灭活 当反应器中的Sf9细胞密度达到2×106/mL，细胞活率不低于95%时，按1 MOI接种重组表达BVDV2 E2蛋白杆状病毒。接毒后，维持体系溶氧(DO)25%～35%，26～28 ℃培养，逐日取样观察细胞病变，当75%以上细胞病变时收获。收获的细胞培养物在2～8 ℃条件下4000～1 0000 r/min离心，收取上清液采用亲合树脂进行纯化后，取样进行蛋白纯度、浓度、琼扩效价检测，并采用BEI进行灭活。灭活完毕，取样进行无菌检验和灭活检验，检验合格后用于疫苗配制。

2.3 半成品检验

2.3.1 无菌检验 将收获的病毒液按现行《中国兽药典》附录[8]进行检验，应无菌生长。

2.3.2 病毒含量测定 将收获的IBRV和BPIV3病毒液用细胞维持液作10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7、10-8、10-95个稀释度，每个稀释度分别接种96孔板培养的MDBK单层细胞，每个稀释度重复4孔，每孔100 μL，置37 ℃、含5% CO2细胞培养箱中继续培养，连续观察5 d，记录特异性细胞病变，计算TCID50。IBRV病毒含量每毫升应不低于108.0TCID50，BPIV3病毒含量每毫升应不低于108.5TCID50。

2.3.3 蛋白效价测定 将收获的BVDV1 E2蛋白抗原和BVDV2 E2蛋白抗原采用琼脂扩散试验法进行效价检测，效价应不低于1∶32。

2.3.4 蛋白纯度检测 取BVDV1 E2蛋白抗原和BVDV2 E2蛋白抗原经SDS凝胶电泳后进行纯度分析检测，均应不低于75%。

2.3.5 蛋白浓度测定 用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行测定，BVDV1 E2蛋白和BVDV2 E2蛋白浓度均应不低于200 μg/mL。

2.3.6 灭活检验 将灭活后的IBRV和BPIV3按细胞维持液的1/10量接种MDBK单层细胞2瓶，吸附1 h后弃去，补加维持液，37 ℃培养3 d。收获病毒液冻融3次，再按细胞维持液的1/10量接种MDBK单层细胞2瓶，37 ℃培养3 d，以细胞不出现典型CPE判为合格。将BVDV2 E2蛋白加入6孔细胞培养板内，每个样品做2个重复孔，置26～28 ℃恒温培养箱中培养7 d，用间接免疫荧光方法进行检测，以细胞不出现特异性绿色荧光判为合格。

2.4 疫苗制备和检验

2.4.1 疫苗制备 将检验合格的IBRV灭活液、BPIV3灭活液、BVDV1 E2蛋白、BVDV2 E2蛋白与605佐剂等比例混合，以100～300 r/min搅拌速度充分混合均匀。

2.4.2 疫苗常规检验 按照现行《中国兽药典》的方法分别进行无菌、黏度、pH值、甲醛残留检测[8]。

2.4.3 疫苗安全性检验

2.4.3.1 小鼠安全性检验 背部皮下接种小鼠10只，每只0.3 mL，观察14 d，记录小白鼠的死亡情况及全身和局部的不良反应。

2.4.3.2 靶动物牛安全性检验 肌肉接种健康易感牛5头，每头4.0 mL，观察14 d，记录局部和全身不良反应。

2.4.4 疫苗效力检验

2.4.4.1 抗体测定法 将疫苗肌肉接种健康易感牛5头，每头2.0 mL，免疫后21 d以相同方式和剂量加强免疫一次，二免后14 d采血，分离血清，分别进行IBRV和BPIV3中和抗体以及BVDV1和BVDV2 E2蛋白琼扩抗体效价测定。

2.4.4.2 攻毒保护法 将疫苗肌肉接种健康易感牛20头，每头2.0 mL，免疫后21 d以相同方式和剂量加强免疫一次，二免后14 d，其中5头免疫牛连同对照牛5头，每头接种IBRV C1株病毒10 mL(含108.3TCID50)；5头免疫牛连同对照牛5头，每头接种BPIV3 HB01株病毒10 mL(含108.5TCID50)；5头免疫牛连同对照牛5头，每头接种BVDV1强毒SD株(病毒含量为105.0TCID50/mL)4.0 mL；5头免疫牛连同对照牛5头，每头接种BVDV2强毒XJ株(病毒含量为105.0TCID50/mL)4.0 mL。攻毒后连续观察14 d，每日测定体温，并于攻毒后第5～9天采集鼻拭子和肛门拭子进行病原检测，考察免疫牛排毒情况。以免疫牛不出现体温升高、不出现临床症状和不排毒作为免疫保护判定标准，统计免疫牛攻毒保护率。

3 结 果

3.1 制苗抗原的培养与检验 将收获的抗原分别进行无菌检验、病毒含量测定、蛋白琼扩效价、纯度、浓度以及灭活检验，结果均符合三联苗工艺规程和质量标准规定，见表1。

表1 抗原制备各项检验结果

3.2 疫苗制备及检验 将检验合格的灭活抗原与605佐剂混合，制备成三联灭活疫苗成品，并进行各项检验。结果显示制备的疫苗外观呈淡粉红色透明液体，黏度为15.3 cP，甲醛残留量为0.08%，pH值为7.2；10只小鼠经安全性检验均健活；采用靶动物牛进行安全性检验，接种后未出现体温升高、精神不振、食欲减退等全身不良反应，接种后注射部位无红肿和溃烂等局部不良反应。

3.3 疫苗效力检验 采用健康易感牛进行疫苗接种后，分别进行抗体测定和攻毒保护试验。免疫组IBRV和BPIV3中和抗体均可达到1∶77以上，BVDV1和BVDV2 E2蛋白琼扩抗体效价4/5以上牛达到1∶32以上，而对照组中和抗体均不超过1∶4，琼扩抗体效价均不超过1∶2；进行攻毒保护试验，免疫牛可达到4/5以上保护，对照牛4/5以上发病。具体试验结果见表2。

表2 疫苗效力试验研究结果

4 结论与讨论

目前，国内已有牛传染性鼻气管炎灭活疫苗(C1株)、牛病毒性腹泻/黏膜病灭活疫苗(1型，NM01株)、牛病毒性腹泻/粘膜病、传染性鼻气管炎二联灭活疫苗(NMG株+LY株)等产品获得国家《新兽药注册证书》，并上市销售。国外已有四联苗研究和上市的相关报道[9]。

本研究采用MDBK细胞微载体悬浮培养技术培养IBRV和BPIV3，采用CHO细胞表达系统表达BVDV1 E2蛋白，采用杆状病毒表达系统表达BVDV2 E2蛋白，抗原经纯化和灭活后与新型水佐剂混合，成功制备出了牛病毒性腹泻/黏膜病(1型+2型)、牛传染性鼻气管炎、牛副流感(3型)三联灭活疫苗，且免疫效果良好。

面对国内外生物技术的迅猛发展，疫苗的类型也由传统的全病毒苗、全菌苗向基因工程疫苗发展；细胞培养也由传统的转瓶培养工艺向生物反应器纯悬浮培养工艺发展；疫苗佐剂也由传统的矿物油佐剂、铝胶佐剂向新型水佐剂发展。本研究采用这些新技术开展了实验室研究，获得了理想的试验结果。