鸡球虫病活疫苗不同卵囊计数方法的比较

张 媛，任小侠，王秀丽，王 楠，李 建，张一帜，刘元杰，褚智菲，宋运娇，于慧娟，赵金羽，高 彬，刘 洋，王晨旭，张 慧，石宗昌，梁正鹏，刘丽丹，吴金香，罗玉峰*，李俊平*

(1.中国兽医药品监察所，北京 100081；2.齐鲁青大生物制药有限公司，山东莱阳265205；3.天津赫莱恩特生物科技有限公司，天津 301702；4.西安斯凯达生物制品有限公司，西安 710399；5.佛山市正典生物技术有限公司，广东佛山 528138)

鸡球虫活疫苗中孢子化卵囊数直接关系到疫苗的安全及效力。我国已批准的9个鸡球虫活疫苗中有7个质量标准中有卵囊计数检验项目，但均未规定具体的计数方法，以上产品注册检验时提供的检验操作规程均采用血细胞计数板4角方格计数法进行[1-3]。《欧洲药典》也要求对球虫活疫苗进行卵囊计数检验，规定选用适宜的计数板进行卵囊计数，也未明确具体的计数方法[4]。有些国外产品，如捷克共和国BIOPHARM生物制品与兽药研究所生产的鸡球虫活疫苗采用麦氏计数板进行卵囊计数。美国国内球虫活疫苗无卵囊计数检验项[5]，如我国批准进口的由英特威美国分公司生产的肉鸡球虫活疫苗和种鸡球虫活疫苗[6]。

目前，鸡球虫活疫苗在采用血细胞计数板4角方格计数法进行卵囊计数检验时，由于方法误差较大，常遇到检验结果不在标准规定范围内的情况，即使同一名检验员检测同一份样品，几次检验的结果间也不稳定，同时会出现低于下限和高于上限的情况，给结果判定造成了困扰。为了解鸡球虫活疫苗常用的不同卵囊计数方法对检测结果准确性的影响，进行了血细胞计数板4角方格法和9方格法以及麦氏计数板法对3种鸡球虫活疫苗卵囊计数结果的统计分析，从而筛选出更为稳定、准确、可靠、易操作的球虫卵囊计数方法，为鸡球虫活疫苗卵囊计数提供可靠的技术参考。

1 材料与方法

1.1 疫苗 疫苗Ⅰ鸡球虫病四价活疫苗(柔嫩艾美耳球虫ETGZ株+毒害艾美耳球虫ENHZ株+堆型艾美耳球虫EAGZ株+巨型艾美耳球虫EMPY株)，疫苗Ⅱ鸡球虫病三价活疫苗(柔嫩艾美耳球虫PTMZ株+巨型艾美耳球虫PMHY株+堆型艾美耳球虫PAHY株)，疫苗Ⅲ鸡球虫病四价活疫苗(柔嫩艾美耳球虫PTMZ株+毒害艾美耳球虫PNHZ株+巨型艾美耳球虫PMHY株+堆型艾美耳球虫PAHY株)，均为已注册上市产品。

1.2 样品处理 样品A为疫苗原液，样品B为疫苗用饱和食盐水稀释后的稀释液。

1.3 卵囊计数 疫苗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ样品A用血细胞计数板进行计数；样品B用麦氏计数板进行计数。

1.3.1 血细胞计数板与麦氏计数板计数结果比较由中国兽医药品监察所(简称“中监所”)的4名检验员用血细胞计数板4角方格法、血细胞计数板9方格法和麦氏计数板法分别重复计数3种疫苗中孢子化卵囊数6次，用6次计数结果平均值计算每羽份疫苗中含有的孢子化卵囊数作为统计值进行t检验，分析3种计数方法的差异显著性。P<0.05表示存在显著性差异，P<0.01则存在极显著性差异。

1.3.2Z比分值计算 选择1.3.1项中差异小的两种方法，由来自中监所和全国4家球虫疫苗生产企业的共16名检验员分别重复计数3种疫苗中孢子化卵囊数6次。以第1～3次计数结果的平均值和6次计数结果去除极大值和极小值后剩余4次计数结果的平均值分别作为统计值，进行Z比分值计算。

根据CNAS-GL02:2014 《能力验证结果的统计处理和能力评价指南》[7]中稳健统计方法，测定Z比分值，用于分析各检验员在总体检测结果中所处的位置。Z比分值采用X、XM、NormIQR来确定[8]。

Z比分值计算公式：Z=(X-XM)/NormIQR

式中：Z为稳健比分值；X为检验数据；XM为中位值；NormIQR为标准化四分位距，NormIQR=0.7413×四分位间距(IQR)。

判定标准为：︱Z︱≤2为满意结果；2<︱Z︱<3时，表示结果可疑；︱Z︱≥3为不满意结果。

1.3.4 不同方法计数结果比较 用1.3.3项中变异系数最小的方法，与血细胞计数板4角方格3次平均值法对16名参比人员的检验结果进行判定，计算检验结果低于标准下限、符合标准和高于标准上限的概率，分析检验结果符合标准规定概率最高的检验方法。再由中监所的9名检验员对疫苗Ⅰ采用新建立的计数方法与血细胞计数板4角方格3次平均值法进行检验，分析检验结果是否符合标准规定。

1.3.5 同一人员计数结果变异系数的计算 对中监所9名检验员的计数结果进行人员内变异系数的计算，根据1.3.4项中的判定结论，确定检验成立的变异系数范围。

2 结果与分析

2.1 血细胞计数板与麦氏计数板比对结果及统计分析 每种样品均由4名参比人员在相同条件下，分别采用血细胞计数板4角方格法、血细胞计数板9方格法和麦氏计数板法进行测试。从表1可见，麦氏计数板法计数结果明显低于血细胞计数板法，统计学分析表明血细胞计数板4角方格法和9方格法计数结果差异不显著(P=0.9969)，但均显著高于麦氏计数板法计数结果(P<0.05)，故采用血细胞计数板4角方格法和9方格法进行人员比对。

表1 3种计数方法计数结果平均值

2.2Z比分值计算 根据Z比分值计算公式，计算16名参比人员每种样品测定结果的Z值(血细胞计数板4角方格法结果见表2，血细胞计数板9方格法结果见表3)。结果显示，16名参比人员中有10名出现可疑或不满意的计数结果，将此10人的计数结果剔除，用剩余6名参比人员(编号01、02、11、13、14、15)的计数结果进行人员间变异系数的统计分析。

表2 4角方格法参比人员Z比分值统计处理结果汇总

表3 9方格法参比人员Z比分值统计处理结果汇总

2.3 不同人员间计数结果变异系数计算 将2.2项中个别检验员可疑及不满意的检验结果剔除，计算剩余6名检验员之间计数结果的变异系数，结果见表4、表5，可知采用血细胞计数板4角方格法进行卵囊计数，同一样品重复计数6次，取6次计数结果去除极大值和极小值后剩余4次计数结果的平均值进行判定的方法变异系数(10.94%)相对较低，说明采用这种方法进行卵囊计数，不同人员的检验结果差异性相对较小。

表4 4角方格法参比人员卵囊计数结果变异系数

表5 9方格法参比人员卵囊计数结果变异系数

2.4 不同方法计数结果比较 疫苗用血细胞计数板4角方格法重复计数6次后，将计数结果分别用第1～3次求平均值法，以及6次计数结果去除极值后剩余4次平均值法进行统计计算，结果见表6。疫苗Ⅰ的判定标准是每羽份疫苗中含有的孢子化卵囊数位于1530～1870之间为合格，疫苗Ⅱ的判定标准是每羽份疫苗中含有的孢子化卵囊数位于360～440之间为合格，疫苗Ⅲ的判定标准是每羽份疫苗中含有的孢子化卵囊数位于990～1210之间为合格，从图1可知采用血细胞计数板4角方格法进行卵囊计数，同一样品重复计数6次，取6次计数结果去除极大值和极小值后剩余4次计数结果的平均值进行判定，计数结果的总体符合率要高于目前使用的4角方格法重复计数3次取平均值进行判定的检验方法。

表6 不同取值方法计算结果

图1 两种方法卵囊计数结果比较

中监所9名检验员用血细胞计数板4角方格法对疫苗Ⅰ进行卵囊计数，每人重复计数9次，用4角方格3次平均值法和4角方格6次去除极值后剩余4次计数结果平均值法分析计数结果，对于4角方格3次平均值法，以第1～3次的平均值作为首检结果，如不符合规定，以第4～6次的计数结果作为重检结果。对于4角方格6次去除极值后剩余4次计数结果平均值法，以第1～6次去除极值后剩余4次计数结果的平均值作为首检结果，如不符合规定，以第4～9次去除极值后剩余4次计数结果的平均值作为重检结果。从表7可见，采用每批检品抽检1瓶，每瓶使用血细胞计数板4角方格法重复计数6次，6次计数结果中去除极大值和极小值后剩余4次计数结果的平均值作为该瓶检品卵囊计数结果，如首次检验不符合规定可重检一次的方法，可以最大程度统一不同人员的检验结论。

表7 不同卵囊计数方法计数结果比较

2.5 同一人员多次计数结果变异系数计算 对中监所9名检验员采用血细胞计数板4角方格法重复计数6次，6次计数结果去除极值后剩余4次计数结果的变异系数进行计算，结果见表8，可见6次计数结果中去除极大值和极小值后剩余4次计数结果的变异系数可作为检验成立的条件，当变异系数≤20%时检验成立。

表8 去除极值后剩余4次计数结果变异系数统计

3 讨论与结论

使用血细胞计数板可以直接进行疫苗检品卵囊计数，不需要进行稀释或浓缩。而麦氏计数板，由于计数室位于计数板的上层，需要使用大量饱和食盐水使卵囊漂浮于液体表面，和上层的计数室处于同一界面才可计数，用饱和食盐水对疫苗进行处理的过程会引入误差，龚振兴等发现不同浓度、不同体积的饱和食盐水对卵囊的漂浮回收率为55%～97%[9-10]，本研究结果也表明使用麦氏计数板的计数结果显著低于血细胞计数板。而且，疫苗充分混匀后卵囊在疫苗中进行布朗运动，吸取的样品更能代表整瓶检品的质量，而加入饱和食盐水后，卵囊不断上浮，很难将其充分混匀，可见，不适宜用麦氏计数板代替血细胞计数板进行疫苗的卵囊计数检验。

血细胞计数板可以用于球虫卵囊的定量检测，但这种方法也存在一定的误差，这些误差包括技术误差和固有误差。技术误差包括加样量不准确、误把未孢子化卵囊计作孢子化卵囊、误把疫苗中的杂质计作卵囊等。研究结果也表明不同检验员卵囊计数的熟练程度有差别，16名参比人员中有10人均出现了可疑或不满意的计数结果。技术误差可以通过规范检验操作和提高检验人员的熟练程度来避免或纠正，需要加强对检验员培训，统一行业操作方法。此外，固有误差包括计数板的精密度误差、方法自身存在的误差、卵囊在计数池内分布不均匀带来的误差等，也是导致计数结果不稳定的关键因素。研究结果表明，采用血细胞计数板4角方格法重复计数6次，取6次计数结果中去除极大值和极小值后剩余4次计数结果的平均值计算每羽份疫苗中含有孢子化卵囊数的方法最能降低误差对检验结果的影响，使不同人员检验结论的一致性更高。从试验数据看，血细胞计数板4角方格法与9方格法在计数结果上没有显著差异，但血细胞计数板4角方格法较9方格法于操作上更简便。变异系数提示对同一瓶疫苗采用血细胞计数板4角方格法重复计数6次，取6次计数结果中去除极大值和极小值后剩余4次计数结果的平均值计算每羽份疫苗中含有孢子化卵囊数的方法较目前使用的重复计数3次取平均值进行计算的方法，人员间的差异更小，是较为理想的一种卵囊计数法。在今后的工作中应针对此方法建立标准操作规程，统一操作细节，规范操作手法，开展长期的、多次的比对活动，获取更多实验数据，从而提升球虫类活疫苗卵囊计数结果的准确性。

目前国内鸡球虫病活疫苗卵囊计数质量标准制定得较为严苛，王鹏等人与第三方检测机构对8批鸡球虫病疫苗进行了卵囊计数，自检与第三方机构检测结果均仅有25%的结果处于疫苗参考标准±10%的范围内[11]。疫苗计数结果的变异系数只有限定在10%以内才能保证计数结果处于疫苗参考标准±10%的范围内，而目前所使用的采用血细胞计数板4角方格法重复计数3次求平均值的检验方法，不同人员间的变异系数为12.25%，高于10%，以致会出现不同人员采用这种方法对同一产品进行检验，检验结果不稳定的情况。即使在改进方法后，采用血细胞计数板4角方格法重复计数6次，取6次计数结果中去除极大值和极小值后剩余4次计数结果的平均值计算每羽份疫苗中含有孢子化卵囊数的方法进行卵囊计数，把不宜作为统计数据的偏离结果去掉，不同人员间的变异系数(10.94%)有所降低，但仍要高于10%。国外产品，如捷克共和国BIOPHARM生物制品与兽药研究所生产的鸡球虫病三价活疫苗，其质量标准要求每羽份含有每种球虫卵囊数为300～500，即每羽份含有的球虫卵囊数是900～1500，标准变异系数约为25%。在和企业检验员沟通过程中也发现，其在检验过程中如出现较高或较低的数据会进行舍弃，在本研究中不进行数据的挑选，16名参比人员采用血细胞计数板4角方格3次平均值法，检品一次检验合格率仅为33.3%，改用血细胞计数板4角方格法重复计数6次，取6次计数结果中去除极大值和极小值后剩余4次计数结果的平均值法后检品一次检验合格率提升为43.7%。中监所9名检验员方法改进前后一次检验合格率可由44.4%(4/9)提升到88.9%(8/9)，必须进行重检才可达到100%(9/9)的检验合格率。可见，检验方法对检验结论有着决定性影响，为提升检验结论的可重复性，建议把卵囊计数方法收录至中国兽药典中，以便统一方法和操作，提升卵囊计数的准确性。同时，进一步修订我国鸡球虫病活疫苗卵囊计数质量标准(如参考标准±20%)，增加其科学性和合理性。