乙酰氨基阿维菌素国家对照品的研制

戴 青，陆连寿，赵富华，张秀英

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

乙酰氨基阿维菌素是乙酰氨基阿维菌素B1a和B1b两个组分的混合物，主要组分为乙酰氨基阿维菌素B1a，是一种高效、广谱、低残留的兽用驱虫药物，是美国食品药品监督管理局和欧盟批准的唯一应用于泌乳奶牛无需弃奶的广谱驱虫药[1-2]，临床上主要用于防治畜类的虱、螨、蝇等各种内外寄生虫，目前制剂为乙酰氨基阿维菌素注射液和乙酰氨基阿维菌素浇泼剂。经国家兽药基础数据库查询，目前我国在有效期内的乙酰氨基阿维菌素原料及制剂的兽药批准文号有100多个。《中国兽药典》一部收载了乙酰氨基阿维菌素与乙酰氨基阿维菌素注射液[3]，质量标准中均需用到乙酰氨基阿维菌素对照品来测定乙酰氨基阿维菌素(B1a+B1b)的含量。美国药典委员会可供应乙酰氨基阿维菌素USP对照品，但国外对照品价格昂贵，购买周期长，给国内相关生产企业和检测机构的质量控制带来不便。因此，拟研制乙酰氨基阿维菌素对照品，用于乙酰氨基阿维菌素及其制剂的鉴别与含量测定，对于兽药生产企业乙酰氨基阿维菌素及制剂的质量控制具有重要意义。

本次研制分别采用质量平衡法与高效液相色谱外标法两种方法对乙酰氨基阿维菌素原料的含量进行定值研究。其中质量平衡法以色谱纯度、水分、残留溶剂、炽灼残渣等关键指标进行定值，高效液相色谱外标法以USP对照品作为溯源对照品进行定值，以确保含量赋值的准确性。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津2010A高效液相色谱仪；Waters Synapt HDMS质谱仪；Agilent 7890A气相色谱仪；Mettler Toledo XS205电子分析天平(精度0.01 mg)； Metrohm 701 KF Titrino卡氏水分测定仪；CWF 11/5高温炉。

1.2 试药 乙酰氨基阿维菌素原料由浙江海正药业股份有限公司生产；乙酰氨基阿维菌素USP对照品批号1237752，含量95.1%(其中乙酰氨基阿维菌素B1a含量90.09%，B1b含量5.01%)；乙腈为色谱纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 溶解度 分别考察乙酰氨基阿维菌素原料在甲醇、乙醇、三氯甲烷、丙酮、水中的溶解度，测定结果(表1)与兽药典中对乙酰氨基阿维菌素溶解度的规定一致。

表1 乙酰氨基阿维菌素原料的溶解度

2.2 引湿性 根据兽药引湿性试验指导原则，将原料在恒温恒湿条件下(温度25 ℃，相对湿度80%)放置24 h后计算增重百分率，判定样品引湿性。结果测得样品的增重百分率为8.7%，表明原料有引湿性。为进一步判定试验条件下暴露时间对水分的影响，将原料在常规试验条件下(温度25 ℃，相对湿度40%)于天平室内敞口放置10、20、30、40、50、60 min，分别计算增重百分率，结果见表2，10分钟内样品增重百分率小于0.5%，随着放置时间延长，逐渐吸湿增重，表明称量时应控制好称量环境的湿度，快速称样。

表2 乙酰氨基阿维菌素原料增重百分率

2.3 高效液相色谱法结构确证 采用2.6项下的高效液相色谱方法，分别取供试品溶液与对照品溶液进样，采集液相色谱图，考察供试品溶液主峰与对照品溶液主峰保留时间是否一致。结果见图1～图2，在乙酰氨基阿维菌素含量测定项下的色谱图中，乙酰氨基阿维菌素原料主峰与对照品溶液主峰的保留时间一致。

图1 乙酰氨基阿维菌素USP对照品液相色谱图

图2 乙酰氨基阿维菌素原料液相色谱图

2.4 高分辨质谱法结构确证

2.4.1 质谱条件 模式：ESI正离子模式；毛细管电压：2kv；锥孔电压：10v；离子源温度：120 ℃；脱溶剂气温度：350 ℃；脱溶剂气流量：500L/h。

2.4.2 供试品溶液的制备 取乙酰氨基阿维菌素原料25 mg，置25 mL量瓶中，用甲醇溶液溶解并稀释至刻度，再用20%甲醇溶液稀释制成每1 mL中含1 μg的溶液，进样测定分子量。

2.4.3 测定结果 在该质谱条件下，乙酰氨基阿维菌素理论分子量为936.5086，供试品的测定分子量为936.5085(图3)。供试品的测定分子量与理论值一致。

图3 乙酰氨基阿维菌素原料质谱图

2.5 质量平衡法定值

2.5.1 色谱纯度

2.5.1.1 液相色谱条件 色谱柱：Waters Sunfire C8(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：0.1%高氯酸溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～15 min，45%A，55%B；15～25 min，5%A，95%B；25～30 min，45%A，55%B；30～35 min，45%A，55%B)；流速：1.5 mL/min；检测波长：245 nm；柱温：40 ℃；进样量：20 μL。

2.5.1.2 供试品溶液的制备 取分装后的乙酰氨基阿维菌素原料25 mg，置50 mL量瓶中，用80%甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.5.1.3 测定结果 采用峰面积归一化法分别计算乙酰氨基阿维菌素B1a和B1b的色谱纯度，结果B1a纯度为96.60%，B1b纯度为2.40%，二者之和为乙酰氨基阿维菌素纯度99.00%。

2.5.2 残留溶剂 据查阅乙酰氨基阿维菌素原料企业的生产工艺可知，原料合成过程中所使用的有机溶剂为乙醇、甲醇和丙酮，因此采用顶空气相色谱法测定这三种有机溶剂的含量。

2.5.2.1 气相色谱条件 色谱柱：Agilent HP-5色谱柱(5%苯基-95%甲基聚硅氧烷为固定液)；程序升温：起始温度50 ℃，保持10 min，再以每分钟10 ℃的速率升温至180 ℃，保持1 min；进样口温度：200 ℃；氢火焰离子化检测器温度：250 ℃；顶空瓶平衡温度：80 ℃；平衡时间：30 min。

2.5.2.2 供试品溶液的制备 取分装后的乙酰氨基阿维菌素原料0.5 g，置20 mL顶空瓶中，精密加入二甲基甲酰胺5 mL，摇匀，即得。

2.5.2.3 对照品溶液的制备 精密称取甲醇、乙醇和丙酮各适量，分别用二甲基甲酰胺稀释制成48 μg/mL的乙醇对照品溶液、8 μg/mL的甲醇对照品溶液和12 μg/mL的丙酮对照品溶液。

2.5.2.4 测定结果 取对照品溶液和供试品溶液分别顶空进样测定，结果供试品中甲醇和丙酮的含量均低于检测限，因此忽略不计。按外标法计算供试品中乙醇的含量，结果为0.05%。

2.5.3 水分 照《中国兽药典》一部附录0832测定水分，结果为1.15%。

2.5.4 炽灼残渣 照《中国兽药典》一部附录0841测定残渣量，结果为0.02%。

2.5.5 质量平衡法计算结果 质量平衡法计算公式为含量=色谱纯度×(1-水分-残留溶剂-炽灼残渣)×100%，按照这公式分别计算乙酰氨基阿维菌素B1a与B1b的含量，结果为B1a：96.60%×(1-1.15%-0.05%-0.02%)×100%=95.42%；B1b：2.40%×(1-1.15%-0.05%-0.02%)×100%=2.37%。乙酰氨基阿维菌素(B1a+B1b)含量为97.79%。

2.6 高效液相色谱外标法定值

2.6.1 液相色谱条件 同2.5.1.1项下色谱条件。

2.6.2 供试品溶液的制备 取分装后的乙酰氨基阿维菌素原料25 mg，置50 mL量瓶中，用80%甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.6.3 对照品溶液的制备 取乙酰氨基阿维菌素USP对照品25 mg，置50 mL量瓶中，用80%甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.6.4 系统适用性溶液的制备 取对照品溶液1.5 mL，置液相进样瓶中，加1滴1 mol/L氢氧化钠溶液，放置20 min后进样。系统适用性溶液色谱图见图4，乙酰氨基阿维菌素B1b峰、B1a峰、杂质C+D峰和杂质E峰的相对保留时间分别为0.77、1.00、1.05和1.29，各峰间分离度均符合要求。

图4 系统适用性溶液液相色谱图

2.6.5 方法专属性研究 为进一步确定杂质的分离情况，应在测定前进行专属性试验考察。在10 mL供试品溶液中分别加入3滴盐酸、1 mol/L氢氧化钠溶液和30%过氧化氢溶液，放置30 min后进样，另取10 mL供试品溶液水浴加热5分钟，放冷后进样测定，结果乙酰氨基阿维菌素均产生了杂质峰，但主峰与杂质均能较好地分离，表明该方法具有较好的专属性，见图5～图8。

图5 酸破坏试验液相色谱图

图6 碱破坏试验液相色谱图

图7 氧化破坏试验液相色谱图

图8 加热破坏试验液相色谱图

2.6.6 测定结果 由三个不同实验室按照该方法进行协作标定，平均结果为乙酰氨基阿维菌素B1a含量95.79%，B1b含量2.39%。乙酰氨基阿维菌素(B1a+B1b)含量为98.18%。

2.7 稳定性影响因素试验 按《中国兽药典》一部附录稳定性试验指导原则要求，进行高温(60 ℃)、高湿(相对湿度90%)和光照(4500lx)试验的稳定性影响因素试验，分装后的样品在放置5 d和10 d后，按2.5.1项下方法考察乙酰氨基阿维菌素的纯度变化。纯度结果见表3，高湿条件下样品几乎无变化，高温对样品略有影响，10 d后纯度下降0.28%，光照对样品影响较大，10 d后纯度下降2.10%。

表3 稳定性影响因素试验结果

3 讨论与结论

3.1 对照品含量赋值 《标准物质定值的通用原则及统计学原理》[4]中列出5种定值方式，单一实验室通常采用两种或更多不同原理的独立参考方法定值。本研究采用质量平衡法与高效液相色谱外标法两种不同原理的定值方法测定乙酰氨基阿维菌素含量，测定结果基本一致，相互佐证，可以保证定值的准确性。质量平衡法通常被认为是一种具有较高准确度的方法，其能够直接溯源到国际单位制中的质量单位，结果稳定性好，测量结果比其他方法更准确，世界卫生组织及欧洲药典推荐质量平衡法为药品标准物质定值方法[5-6]。虽然本研究两种方法测定结果基本一致，但考虑到外标法溯源各人间偏差较大，因此本研究最终采用质量平衡法的定值结果对含量进行赋值。

3.2 对照品的稳定性 对照品具有较好的稳定性是标准物质的一个重要前提，使用中需要特别注意稳定性问题。本试验通过对该对照品进行高温、高湿和光照稳定性考察，结果表明该对照品对热和光照均比较敏感，因此应避光低温保存。同时为了保证对照品在保存条件下的含量值的准确性，根据兽药标准物质研制技术规范[7]要求，我们还应对制备的对照品进行稳定性监测，即在规定的贮存条件下，定期地进行标准物质特性值的稳定性评估。分析该对照品的特性，由于该对照品采用安瓿分装，水分、残留溶剂和残渣都基本不会发生变化，因此最能反映该对照品的变化的特性值为纯度，因此确定第一次监测时间为一年后，以后每年定期测定一次。对该对照品的纯度进行考察，由1人进行测定，每次测定平行样不少于5份，测定的结果与原纯度结果相对偏差不得大于0.3%。