HPLC法同时测定四红丹中5种成分

马春娟， 王慧卓， 李 冰， 王月洁， 赵家彬， 鲍慧玮*

(1.长春医学高等专科学校药品食品学院，吉林 长春 130000；2.白城市食品药品检验所，吉林 白城 137000；3.白城市医院，吉林 白城 137000；4.长春中医药大学药学院，吉林 长春 130117)

四红丹是由当归、大黄、地榆(炭)、槐花(炭)、当归(炭)、大黄(炭)6味药材组成的复方制剂，收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》第1册(标准编号WS3-B-0525-91)[1]，具有清热止血功效，用于治疗吐血、衄血、便血、妇女崩漏下血[2]。方中药效物质较多，如阿魏酸是当归有机酸类活性成分，具有补血活血、调经止痛作用[3-4]，也是2020年版《中国药典》当归项下含量测定的指标成分[5]；槐花中主要活性成分芦丁是一种无毒的生物类黄酮，具有抗炎、止血作用[6-7]；大黄中大黄酚、大黄素甲醚为蒽醌类化合物，也具有清热泻火、凉血解毒等功效[8-11]，全方将地榆、槐米、当归、大黄制炭，所谓“出血者属热者十之八九”[12-13]，从而增强了止血效果。

中药复方制剂组成复杂，故既要从整体功效出发，又要从个体成分入手来揭示其临床作用。前期查阅文献发现，尚无关于四红丹质量控制的报道，故本实验建立HPLC法同时测定方中没食子酸、芦丁、阿魏酸、大黄酚、大黄素甲醚的含量，以期为其质量评价提供参考依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；DHG-912A型电热鼓风干燥箱(上海精密科学仪器有限公司)；AB135-S型分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；R系列旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司)；多功能高速中药粉碎机(温州顶历医疗器械有限公司)。

1.2 试剂与药物 四红丹(自制，批号20200501、20200502、20200503、20200504、20200505，9 g/丸)。当归、大黄、地榆、槐花等药材均购于吉林大药房，经长春中医药大学肖井雷副教授鉴定为正品，符合2020年版《中国药典》一部项下规定。没食子酸(批号110831-201906，纯度91.5%)、阿魏酸(批号110773-201915，纯度99.4%)、芦丁(批号100080-201811，纯度91.7%)、大黄酚(批号110796-201922，纯度99.4%)、大黄素甲醚(批号110758-201817，纯度99.2%)对照品均购于中国食品药品检定研究院。甲醇为色谱纯[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]；甲醇、磷酸为分析纯(北京化工厂)；水为纯净水(杭州娃哈哈集团股份有限公司)。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备 精密称取没食子酸对照品6.44 mg，甲醇溶解至2 mL量瓶中，摇匀。分别精密称取大黄酚、大黄素甲醚、阿魏酸对照品6.75、8.89、5.59 mg，置于10 mL量瓶中，甲醇溶解定容，摇匀。精密称取芦丁对照品14.75 mg，再精密吸取上述溶液各1 mL，甲醇定容至10 mL量瓶中，摇匀，制得各成分质量浓度分别为0.322、1.475、0.067 5、0.088 9、0.055 9 mg/mL的贮备液，精密吸取1 mL，甲醇稀释10倍，即得(各成分质量浓度分别为32.2、147.5、6.75、8.89、5.59 μg/mL)。

2.2 供试品溶液制备 取本品适量，剪碎(约10目)，精密称取9 g，置于锥形瓶中，加入10倍量70%甲醇回流提取30 min，滤过，重复2次，合并滤液，旋蒸蒸干，甲醇定容至10 mL，精密吸取1 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 阴性样品溶液制备 分别取处方量的缺当归-当归(炭)、缺大黄-大黄(炭)、缺当归-地榆(炭)-槐花(炭)-当归(炭)、缺当归-当归(炭)-大黄-大黄(炭)-槐花(炭)-地榆(炭)，按照工艺制成相应阴性样品，按“2.2”项下方法制备，即得。

2.4 色谱条件 Phenomenex C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相甲醇(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脱(0～10 min，10%A；10～30 min，10%～30%A；30～45 min，30%～40%A；45～53 min，40%～53%A；53～78 min，53%～85%A；78～90 min，85%A)；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长275 nm(没食子酸、芦丁、大黄酚、大黄素甲醚)、322 nm(阿魏酸)；进样量20 μL。

2.5 系统适应性考察和专属性试验 取对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在“2.4”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分色谱峰与相邻峰分离良好，理论塔板数均大于3 000，阴性无干扰。

1.没食子酸 2.芦丁 3.大黄酚 4.大黄素甲醚 5.阿魏酸1.gallic acid 2.rutin 3.chrysophanol 4.physcion 5.ferulic acid

2.6 方法学考察

2.6.1 线性关系考察 精密吸取“2.1”项下对照品溶液0.2、0.4、1、2、4、10 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，在“2.4”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系

2.6.2 稳定性试验 取同一份供试品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h在“2.4”项色谱条件下进样测定，测得没食子酸、芦丁、大黄酚、大黄素甲醚、阿魏酸峰面积RSD分别为0.74%、1.66%、0.45%、0.91%、1.25%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.6.3 精密度试验 取同一份供试品溶液，在“2.4”项色谱条件下进样测定6次，测得没食子酸、芦丁、大黄酚、大黄素甲醚、阿魏酸峰面积RSD分别为0.43%、1.05%、0.72%、0.35%、0.96%，表明仪器精密度良好。

2.6.4 重复性试验 取本品(批号20200501)适量，剪碎，精密称取6份，每份约9 g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.4”项色谱条件下进样测定，测得没食子酸、芦丁、大黄酚、大黄素甲醚、阿魏酸含量RSD分别为1.38%、1.89%、1.53%、1.61%、1.92%，表明该方法重复性良好。

2.6.5 加样回收率试验 取各成分含量已知的本品若干丸，剪碎，分成6份，每份约4.5 g，精密加入芦丁对照品10.25 mg、没食子酸对照品溶液(0.456 mg/mL)5 mL、大黄酚对照品溶液(0.483 mg/mL)1 mL、大黄素甲醚对照品溶液(0.625 mg/mL)1 mL、阿魏酸对照品溶液(0.792 mg/mL)0.5 mL，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.4”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表2。

2.7 样品含量测定 制备5批样品，每批剪碎，取约9 g，精密称定，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.4”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表3。

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法选择 本实验首先考察了甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯对四红丹提取效果的影响，发现甲醇提取时效率高，杂质少，而且它为流动相组成部分，色谱图中干扰主峰的杂质较少，有利于测定。再考察了回流提取、浸渍、超声提取等方法，发现浸渍法时间较长，提取率低；回流提取法时间较短，提取更完全；超声提取法虽然操作简便快捷，但时间较长，提取也不够完全。最终确定，供试品溶液制备方法为70%甲醇回流提取30 min。

3.2 检测波长选择 本实验参考2020年版《中国药典》和文献[14-17]报道，考察了检测波长275、322、254、257 nm，根据各成分色谱峰峰形及吸收情况，最终确定为275 nm(没食子酸、芦丁、大黄酚、大黄素甲醚)、322 nm(阿魏酸)。

表2 各成分加样回收率试验结果(n=6)

表3 各成分含量测定(mg/丸，n=3)

3.3 流动相选择 本实验考察了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.05%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、甲醇-0.1%磷酸[18-20]，发现以甲醇-0.1%磷酸洗脱时各成分色谱峰峰形与相邻峰的分离度较好，出峰时间适宜，最终确定其作为流动相。

3.4 体积流量选择 体积流量过小时，分析时间较长，影响实验效率；体积流量过大时，系统压力上升，从而对色谱柱造成一定损害。本实验考察了体积流量0.5、1、1.5 mL/min对5种成分分离效果的影响，最终确定为1 mL/min。