下调DJ-1基因对甲状腺乳头状癌细胞增殖和侵袭影响的研究

万颜凯，黄小华，麦秀章，曾宪明

1.东莞市企石医院 病理科，广东 东莞 523500；2.东莞市企石医院 预检分诊，广东 东莞 523500；3.东莞市企石医院 客服中心，广东 东莞 523500；4.东莞市企石医院 外科，广东 东莞 523500

0 引言

近些年来，甲状腺乳头状癌的发病率呈现持续上升，虽然甲状腺乳头状癌患者的预后大部分呈良好趋势，死亡率较低，但临床随访资料也发现，远处转移和复发属于患者恶性进展的危险因素，一旦患者出现转移或者复发的情况，其恶性程度明显增高，患者死亡率也随之上升[1-2]。因此，探寻有价值的甲状腺乳头状癌的预后评估分子指标和分子治疗靶点对早期预测患者预后和及时干预具有重要临床价值。本研究采用siRNA技术下调人甲状腺乳头状癌TPC-1细胞株中DJ-1蛋白表达，进而观察细胞的迁移和侵袭行为变化情况，初步分析DJ-1基因调控甲状腺乳头状癌细胞发生迁移及侵袭行为的可能发生机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人甲状腺乳头状癌TPC-1细胞株，DJ-1 siRNA 正义链序列：正义链序列5′-GCUCUGU UGGCUCAUGAAATT-3′，由上海吉玛公司合成，非特异随机序列由上海吉玛公司赠送，Scramble 正义链序列：5′-UUCUCC GAACGUG UCACGUTT-3′。RPMI-1640培养基和10%胎牛血清购自美国Hyclone公司，脂质体lipofectamine TM 2000购自美国Invitrogen公司。BCA法蛋白定量测定试剂盒海门碧云天生物技术公司。Transwell实验所用的小室购自Corning。Matrigel matrix购自BD。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

RPMI-1640培养基（含10%胎牛血清）中对人甲状腺乳头状癌TPC-1细胞株进行培养，培养条件：37℃，5% CO2饱和湿度。

1.2.2 实验分组和转染

转染分3个组：空白对照组：对人甲状腺乳头状癌TPC-1细胞不做任何处理。转染非特异性对照组：对细胞转染Scramble RNA 20nmol/L，并加入适量Lipofect 2000TM；转染si DJ-1组对细胞转染DJ-1 siRNA 20nmol/L，并加入适量Lipofect 2000TM。各组实验细胞均孵育20min（室温条件），然后转移至培养板中，24h后即可收集细胞。

1.2.3 Western印迹法（WB）

应用WB法检测各组实验细胞中DJ-1蛋白表达情况。收集各组细胞，加入细胞裂解液，让细胞得到充分裂解后进行总蛋白提取，提取后进行BCA法蛋白定量测定蛋白含量，然后进行WB检测。

1.2.4 细胞迁移和侵袭行为观察实验

（1）细胞迁移实验操作过程：在迁移小室中加入各组细胞悬液，注意迁移小室滤膜是没有细胞外基质胶，继续培养24h后，将迁移小室拿出，倒弃内部的培养液，采用棉签将表面没有迁移的残留细胞轻轻擦拭，并将小室滤膜下表面的细胞立即采用无水乙醇固定，然后加入结晶紫染色。对染色后的细胞进行显微镜下观察，随机五个视野（×100）观察细胞并计数，计算平均值。

（2）细胞实验操作过程：首先进行细胞外基质胶的配置，按照6.7%的比例，在Transwell小室内加入20μl含MatrigelTM的培养液，使Transwell小室滤膜表面形成一层细胞外基质胶。在Transwell小室中加入各组细胞悬液，继续培养36h后，将Transwell小室拿出，倒弃内部的培养液，采用棉签将表面未穿过聚碳酯膜小孔的残留细胞及表面细胞外基质胶轻轻擦拭，立即采用无水乙醇固定穿过小孔细胞，然后加入结晶紫染色。显微镜下（×100）随机五个视野观察细胞并计数，取其平均值作图分析结果。

1.3 统计学方法

应用SPSS 19.0版统计软件进行数据分析。计量资料采用t检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 三组DJ-1蛋白的表达水平比较

转染si DJ-1组DJ-1蛋白的相对表达量明显较空白对照组和转染非特异性对照组减弱（P＜0.05），而后两者之间比较，DJ-1蛋白相对表达量相似，差异无统计学意义（P＞0.05，图1）。表明转染si RNA后，人甲状腺乳头状癌TPC-1细胞株中DJ-1蛋白表达水平明显受到了抑制。

2.2 DJ-1-siRNA对甲状腺乳头状癌TPC-1细胞株体外迁移力和侵袭力的影响

在细胞迁移和侵袭实验中，转染si DJ-1组中迁移穿膜和侵袭穿膜的细胞数量均明显少于空白对照组和转染非特异性对照组（t迁移=4.494，4.481，t侵袭=4.039，3.594，P＜0.05），而后两者之间，差异无统计学意义（t=2.068，2.141，P＞0.05），见表1和图2、图3。说明沉默DJ-1表达后，甲状腺乳头状癌TPC-1细胞株的运动能力和侵袭能力明显受到抑制。

表1 DJ-1-siRNA 对甲状腺乳头状癌TPC-1 细胞株体外迁移力和侵袭力的影响

3 讨论

尽管大部分甲状腺乳头状癌的恶性潜能相对不高，病例的预后尚佳，患者10年生存率有95%以上，但临床会遇到一些发生复发转移的病例，其预后不佳，死亡率明显增高[3]。目前，甲状腺癌的分子生物靶向治疗受到美国甲状腺协会和美国国立综合癌症网络的推荐，能让患者获得更有利的治疗方案。因此，探明甲状腺乳头状癌发生转移和复发的具体调控机制，寻找有价值的甲状腺乳头状癌的预后评估分子指标和分子治疗靶点成为近年来的研究热点[4-5]。

近年来，国内外较多文献对DJ-1基因参与恶性肿瘤发生和恶性演进的作用机制进行了研究，结果发现DJ-1的细胞转化、抗凋亡、抗氧化应激等调控功能在恶性肿瘤的发生发展过程中可能起重要作用[6-9]。目前，在甲状腺癌中DJ-1 基因表达情况相关研究报道不多，且仍存在争议，国内李海研究[10]检测到 DJ-1在甲状腺癌组织中出现高表达，推测其应与甲状腺癌的发生密切相关，但没有发现DJ-1高表达与甲状腺癌预后有相关性；而国内郦秀芳[11]相关研究却发现甲状腺癌的发生、浸润、淋巴结转移等恶性临床特征与DJ-1过表达密切相关。本研究前期结果显示，甲状腺乳头状癌组织中存在DJ-1特异性高表达，且伴有DJ-1高表达的病例出现更强的浸润和转移等恶性生物学行为。

在此研究基础上，本研究设计了DJ-1基的siRNA序列，并转染甲状腺乳头状癌细胞株进一步沉默DJ-1表达，检测结果发现经过si DJ-1转染后，转染组细胞中DJ-1蛋白受到明显抑制，相对表达明显较其他两对照组减弱（P＜0.05），说明经过转染si RNA后，沉默了甲状腺乳头状癌细胞中DJ-1蛋白表达。进一步体外观察si RNA DJ-1转染对甲状腺乳头状癌细胞发生迁移和侵袭行为的影响，结果显示转染组细胞发生迁移穿膜细胞数和侵袭穿膜细胞数均出现显著减少，说明转染siRNA后，沉默了DJ-1表达，抑制DJ-1表达后，随之该基因涉及的一系列调控作用也被抑制，进而对甲状腺乳头状癌细胞的迁移和侵袭行为起到了一定抑制作用，提示了DJ-1可能与甲状腺乳头状癌的侵袭转移存在相关性，DJ-1高表达将调控甲状腺乳头状癌细胞发生迁移、侵袭行为，通过以后更为深入的相关机制研究，了解DJ-1的分子调控机制，将有望为甲状腺乳头状癌发生复发和转移者的分子靶向治疗提供新靶点和研究方向。