秸秆基乳酸微生物细胞工厂研究进展

龚贵平,吴 波,刘林培,胡国全,何明雄

(农业农村部 沼气科学研究所,生物质能技术研究中心,四川 成都 610041)

乳酸(LA),是一种重要的有机酸,其年消费量约占有机酸总消费量的15%以上,已经被广泛应用至食品、医药、包装、塑料等领域[1]。根据分子手性差异,乳酸又被分为L-乳酸和D-乳酸。由于乳酸分子中同时具有羟基和羧基,具备多个分子聚合形成聚合物的基础,可以制备聚乳酸材料。聚乳酸是一种重要的热塑聚合物,由于其良好的生物相容性和生物降解性,目前已经被广泛应用至食品包装、纺织加工、医用材料、农用薄膜生产等众多领域[1]。随着我国颁布更为严格的“限塑令”以及人们对于绿色、环保和可回收材料的需求日益增加,生物可降解材料越来越受到人们的重视和市场青睐,乳酸的市场需求量也呈现较大规模的增长,据估计,2025年全球乳酸需求量将达到196万t[2]。目前,乳酸的生产方法主要包括发酵法、酶法和化学合成法[3]。据估计,全世界90%的乳酸是通过发酵法生产的[2,4-5]。在乳酸发酵中,出于技术和成本考虑,目前常用的原料仍是淀粉,通过水解淀粉制备糖液,再进行乳酸发酵仍是主流方法。但该方法存在与人争粮的风险,且不利于大规模发展,这极大地限制了乳酸及聚乳酸行业的进一步发展。寻找更加廉价、可持续的乳酸发酵原料成为今后的一大研究重点和热点。第二代生物炼制过程,即基于木质纤维素原料的发酵过程,对于乳酸发酵将是更具前景且更易于扩大应用的方法[2,6]。

秸秆作为一种农业种植副产物和废弃物,是重要的可再生生物质资源。在我国,秸秆主要以玉米、小麦、高粱、水稻、油菜、甘蔗及其他农作物茎秆为主。据2018年数据统计,我国每年产生各类秸秆近10亿t,可收集量达到近9亿t[4,6]。秸秆主要成分包括纤维素、半纤维素、木质素及少量蛋白质等其他成分。通过各类物理或化学预处理及酶解,可以将秸秆转化为可发酵糖(葡萄糖、木糖等),同时也产生各种抑制物,如,糠醛、5-羟甲基糠醛(HMF)及酚类物质等。经过内源产乳酸菌(LAB)发酵,或在各类微生物细胞工厂中构建异源表达途径,可以将糖类物质转化为乳酸。目前,以秸秆为原料生产乳酸仍面临几大问题,如,秸秆结构复杂难以分离、糖类物质共利用困难、预处理过程产生各类有毒抑制物、纤维素酶价格较高、底物和产物抑制等[2,6-7]。为了解决这些问题,许多新型技术已经被开发并应用至乳酸的高效生产中,如,高产乳酸的筛选和构建、新型预处理技术、同步糖化发酵工艺、抑制物耐受性菌株筛选及选育等[2,8]。除此之外,为了进一步减少生产步骤和降低发酵成本,一些研究也尝试在微生物中表达纤维素酶生产基因,将秸秆直接转化为可发酵糖,进一步生产乳酸[9]。笔者介绍了以各类秸秆为原料,通过内源产乳酸菌发酵或异源途径构建生产乳酸,以及发酵过程的控制和策略选择的最新研究进展,并对以秸秆为原料生产乳酸面临的主要挑战和解决办法进行了介绍与总结。

1 乳酸微生物细胞工厂的构建

1.1 传统乳酸发酵

传统乳酸发酵是指人们利用乳酸菌等微生物转化糖类物质生产乳酸的过程。乳酸发酵遍布人们生活的各个方面,如,人们熟知的酸奶发酵、泡菜发酵和食品酿造等[10]。乳酸发酵对于人类发展十分重要,人们通过使用产乳酸菌保存食物,在产生乳酸的同时,也营造了酸性低氧环境,能促进有益菌的生长,并阻止其他微生物的生长,可以延长食物保质期,同时发酵产生的风味物质也给食物带来了特定的风味或香气。常见的乳酸发酵菌种包括乳酸菌、片球菌、乳杆菌、嗜热链球菌、双歧杆菌、米根霉等[10-11]。

乳酸发酵分为同型乳酸发酵和异型乳酸发酵,两者均以葡萄糖作为底物合成乳酸,且均在无氧条件下进行,1 mol葡萄糖产生2 mol ATP。其不同点在于,同型乳酸发酵过程中,葡萄糖首先通过糖酵解途径(EMP途径)被分解为丙酮酸,丙酮酸在乳酸脱氢酶的作用下,生成乳酸。理论上1 mol葡萄糖可以转化为2 mol乳酸(理论转化率为100%),实际生产中,由于微生物存在其他生理活动会消耗部分碳源,所以通常转化率80%以上被认为是同型乳酸发酵[12]。而在异型乳酸发酵中,由于缺乏磷酸果糖利用的酶,葡萄糖经过磷酸戊糖途径(PPP途径)首先被转化为5-磷酸核酮糖,进一步被转化为5-磷酸木酮糖,随后在磷酸酮解酶(PK)的催化下,生成3-磷酸甘油醛和乙酰磷酸,前者进入EMP途径被转化为丙酮酸,进一步生成乳酸;后者在磷酸转乙酰酶(PTA)的催化下,生成乙酰辅酶A,再经乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶催化,最终生成乙醇(或乙酸)及CO2,故异型乳酸发酵产物为1分子乳酸、1分子乙醇(或乙酸)和CO2,乳酸理论转化率仅为50%[12]。

1.2 乳酸发酵细胞工厂的构建

传统乳酸通过微生物内源产乳酸代谢途径生产乳酸,其发酵周期长、营养要求高、过程不易控制且乳酸产量较低,不适合大规模扩大生产,无法满足人们的需求。随着代谢工程和合成生物学的快速发展,人们已经可以快速地对微生物代谢途径进行设计和重构,高效生产所需的化合物。在各种内源产乳酸菌中,研究者应用了各种方法,以提高其乳酸产量。Zhang等[13]对凝结芽孢杆菌BacilluscoagulansD-DSM1进行改造,删除了2个内源L-乳酸脱氢酶基因(ldhL1和ldhL2),并在ldhL1基因的位置插入来源于徳氏乳杆菌Lactobacillusdelbrueckii的D-乳酸脱氢酶基因LdldhD,可以实现培养基不灭菌(培养温度50 ℃)的D-乳酸高效生产,产量为145 g/L,转化率为0.98 g/g,光学纯度达到99.9%。在副干酪乳杆菌Lactobacillusparacasei中,Tian等[14]通过构建CRISPR-Cas9系统敲除D-乳酸生产基因(lhdD)并引入ldhL1基因,提高了L-乳酸的光学纯度(超过99.0%)和产量(220 g/L),产率达到7.5 g/L/h。通过适应性进化,筛选得到了耐受高温的菌株,实现在高糖条件下的开放式L-乳酸发酵生产。除了在内源产乳酸菌中进行代谢工程改造生产乳酸外,通过构建异源表达途径,许多内源不产乳酸的微生物也被用于乳酸生产。这些微生物包括酿酒酵母、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等。研究者在缺乏乳酸生产能力的酿酒酵母中,通过表达来源于肠膜明串珠菌LeuconostocmesenteroidesATCC 8293的专一性催化D-乳酸合成的D-乳酸脱氢酶基因(ldhA,LEUM_1756),实现了在酿酒酵母中D-乳酸的生产。随后,通过敲除竞争性途径基因,如,丙酮酸脱氢酶基因(PDC1)、乙醇脱氢酶基因(ADH1)和3-磷酸甘油脱氢酶基因(GPD1、GPD2),提高了D-乳酸产量,达到112 g/L,产率为2.2 g/L/h[15-16]。Zhao等[17]在大肠杆菌SZ470中插入来源于乳酸片球菌Pediococcusacidilactici的L-乳酸脱氢酶基因ldhL,通过敲除乙醇脱氢酶基因ahdE及适应性进化,实现了以木糖为原料合成L-乳酸。当木糖质量浓度为70 g/L时,L-乳酸产量为62 g/L,产率为1.63 g/L/h,光学纯度达到99.5%,木糖转化率为97%。在枯草芽孢杆菌中,研究者评估了5种外源D-乳酸脱氢酶基因的表达情况,这些基因包括来源于凝结芽孢杆菌B.coagulans的ldhA和gldA101以及来源于3种德氏乳杆菌L.delbrueckii的ldhA基因。结果表明,来源于德氏乳杆菌的一个lhdA基因具有最高的D-乳酸合成催化活性,在37 ℃时,D-乳酸产量为1 mol/L,在48 ℃时,D-乳酸产量为0.6 mol/L(转化率为0.99 g/g葡萄糖)[18]。人工多菌体系,又称混合发酵或混菌发酵,其原理是通过将产物合成途径划分为多个模块,并分配到多个细胞或宿主中进行表达,在进行共培养时,底物可以经多个代谢模块和多个宿主转化,生成产物。该方法有助于降低底盘细胞的代谢压力,提高底物转化效率,解除反馈抑制,使得代谢途径的全局调控更加灵活[19]。作为合成生物学的最前沿,人工多菌体系也已经被应用至乳酸生产中。在一些乳酸菌中,由于其异型乳酸发酵特性,往往会产生许多副产物,如,乙酸、乙醇等,导致乳酸产率降低,并且增加乳酸回收纯化的成本。因此,采用同型和异型乳酸发酵菌混合培养是一种减少副产物产生的策略,利用可以快速同化葡萄糖的同型乳酸发酵菌,可以改变异型乳酸发酵菌的木糖代谢方式,减少副产物产生[8]。Zhang等[20]构建短乳杆菌LactobacillusbrevisATCC 367和植物乳秆菌LactobacillusplantarumATCC 21028混合培养体系,利用生物质水解糖进行乳酸发酵。L.brevis是一种异型乳酸发酵微生物,可以同时利用葡萄糖和木糖生产乳酸,但转化率较低,为0.52 g/g。当和L.plantarum进行混合培养时,乳酸转化率明显上升,为0.8 g/g,并且副产物积累有明显降低。除此之外,由于许多微生物中缺乏木糖代谢途径,无法同时利用秸秆水解液中的葡萄糖和木糖。设计和构建能够同时利用葡萄糖和木糖进行乳酸发酵的人工多菌体系(一种微生物只利用葡萄糖产乳酸、一种微生物只利用木糖产乳酸),可以有效提高底物利用效率,也是一种重要的乳酸发酵策略。

2 以秸秆为原料生产乳酸

秸秆主要成分为纤维素(由β-1,4糖苷键连接的D-葡萄糖线性多聚物,占50%～60%)、半纤维素(各种糖类物质的支链多聚物,包括D-木糖、L-阿拉伯糖、D-甘露糖和D-半乳糖,占10%～30%)和木质素(由香豆醇、松柏醇和芥子醇形成的无定形单晶聚合物,占10%～20%)。经过水解,秸秆可以被转化为可发酵单糖,这些可发酵糖主要为葡萄糖、木糖、阿拉伯糖等。通过各类微生物细胞工厂,这些可发酵糖可以被转化为乳酸,它们在微生物中的代谢途径如图1所示。当以葡萄糖作为底物时,在大多数微生物中,葡萄糖首先通过糖酵解途径被转化为丙酮酸,随后在乳酸脱氢酶的催化下,生成乳酸。除此之外,在一些微生物中,葡萄糖首先在己糖激酶的催化下,被转化为6-磷酸葡萄糖,随后进入磷酸戊糖途径,生成5-磷酸木酮糖。5-磷酸木酮糖进一步被转化为3-磷酸甘油醛和6-磷酸果糖,两者会再次进入糖酵解途径,转化为丙酮酸,最后,丙酮酸生成乳酸。当以木糖作为底物时,其代谢途径与葡萄糖不同,木糖可以通过木糖还原酶(XR)、木糖脱氢酶(XDH)和木酮糖激酶(XK)3个酶催化下被转化为5-磷酸木酮糖,也可以直接在木糖异构酶(XI)单酶作用下,转化为5-磷酸木酮糖。根据微生物种类不同,5-磷酸木酮糖具有不同的代谢途径。5-磷酸木酮糖可以进入磷酸戊糖途径,被转化为3-磷酸甘油醛和6-磷酸果糖,再进入糖酵解途径被转化为丙酮酸和乳酸。另外,5-磷酸木酮糖也可以通过磷酸转酮酶途径(PK途径)被利用,即在PK和PTA催化下,生成等摩尔的乳酸、乙醇(或乙酸)及CO2。阿拉伯糖则被转化为木糖醇,随后生成5-磷酸木酮糖,进一步被转化为乳酸。除此之外,以玉米秸秆和高粱秸秆为例,考虑到湿秸秆中还存在一定量的果糖或蔗糖,图1还列举了利用果糖和蔗糖为原料生产乳酸的代谢途径。

LDH—L-乳酸脱氢酶;DLDH—D-乳酸脱氢酶;ADH—乙醇脱氢酶;PDC—丙酮酸脱羧酶图1 秸秆基乳酸微生物细胞工厂构建及代谢通路Fig.1 Construction and metabolic pathways of straw-based lactic acid microbial cell factory

在各种微生物中,葡萄糖是最容易被利用的碳源,许多微生物中没有木糖利用代谢途径,当以秸秆作为原料生产乳酸时,需要引入外源木糖代谢途径。除此之外,以木糖为底物时,由于不同代谢途径的存在,会造成副产物(乙醇、乙酸、CO2等)积累,不利于乳酸的转化。通过代谢途径抑制及代谢流重定向,可以抑制竞争途径,提高底物转化率[8]。

秸秆水解可以通过化学催化和酶催化完成。化学催化需要相对较高的温度,容易产生有毒物质,而酶催化则只需相对较低的能量输入,且具有更高的转化效率。然而,酶催化水解过程却受到秸秆相对稳定的结构阻碍,使得酶无法有效地附着并催化水解。因此,秸秆预处理是一个必需的过程,有助于打开秸秆的复杂结构,有效促进多糖的快速水解和释放。预处理打开纤维素结构的同时,其苛刻条件导致部分半纤维素和木质素降解产生有毒抑制物,对后续酶解和发酵产生抑制。常用的以秸秆为原料的乳酸发酵策略是分步糖化发酵(SHF),即将预处理后的秸秆进行酶解,生成可发酵糖,再接种产乳酸菌进行发酵,生产乳酸。相比于分步糖化发酵,同步糖化发酵(SSF)产乳酸则更具优势。因为在SHF中,往往存在着反馈抑制。反馈抑制通常发生在酶水解过程中,当纤维素被纤维素酶破坏分解产生葡萄糖时,随着葡萄糖摩尔浓度的增加,纤维素酶活性会被抑制,从而降低水解和糖形成速率。在SSF中,纤维素水解和发酵在一个体系中同时进行,水解产生的糖类物质可以很快被转化为产物,可以解除糖对酶的抑制作用,有效减少末端产物抑制,提高酶解和发酵效率。目前,SSF仍存在一定问题,例如,大多数纤维素酶的最适酶解温度为45～50 ℃,而大多数微生物在高温条件下无法生长,造成酶解和发酵温度不一致[4]。目前,只有少数几种耐热微生物可以实现同步糖化发酵生产乳酸,如,凝结芽孢杆菌、耐热乳酸菌、枯草芽孢杆菌等[21]。

重组纤维素酶分解策略(RCS)的目的是模拟内源纤维素降解微生物,对产乳酸菌进行工程化设计和改造,使其拥有纤维素酶分泌能力,无须对秸秆进行预处理和水解,直接使用一锅法将秸秆发酵转化为乳酸[2]。这可以极大地降低乳酸的生产成本。通过在产乳酸菌中表达纤维素酶生产相关基因,并将纤维素酶分泌至胞外,可以将纤维素有效地分解为葡萄糖。这些酶包括外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶。目前,RCS已经在一些产乳酸菌中得到应用。研究者将来源于热纤梭菌的内切葡聚糖酶(Cel8A)引入乳酸菌L.plantarum中,可以实现乳酸菌以5～6个葡萄糖单元的纤维低聚糖为底物的生长[22]。在乳酸乳球菌Lactococcuslactis中,研究者通过构建人工操纵子,实现了内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的分泌表达,该菌株可以代谢纤维八糖生产L-乳酸[23]。虽然RCS在产乳酸菌中已经有一些应用,但通过RCS进行纤维素水解仍然面临许多问题和挑战。在工程化产乳酸菌中,据报道,外源表达的纤维素酶分泌对于微生物是有毒的,且其分泌途径会饱和[2],这极大限制了重组产乳酸菌分泌的纤维素酶的数量。因为其不能完全、有效地降解复杂木质纤维素结构,使得它们只能代谢和水解,拥有8～9个纤维素单元的短链纤维糊精或部分降解纤维素。与内源产纤维素酶的热纤梭菌相比,重组产乳酸菌中表达的纤维素酶酶活仅为100 U/L,而热纤梭菌中为100～1 000 U/L。除此之外,由于纤维素酶对细胞生长有抑制,需要使用诱导性启动子延迟纤维素酶的表达,将细胞生长和纤维素酶表达过程分开。然而,目前这些启动子尚未实现商业化使用,因为其使用量较大,从而增加了成本。同步糖化共培养发酵(SSCF)是解决上述问题的一种方法,将乳酸生产菌和纤维素酶分泌菌进行共培养,可以实现以纤维素为原料生产乳酸。Shahab等[24]构建了人工的真菌-细菌群体,实现了以木质纤维素为原料合成乳酸。通过构建好氧的产纤维素酶的里氏木霉和兼性厌氧的乳酸菌共培养体系,当以质量分数为5%的微晶纤维素作为底物时,乳酸产量达到34.7 g/L。进一步地,通过联合生物加工过程(CBP),实现了己糖和戊糖的同时利用,当以未脱毒的蒸汽爆破预处理榉木作为原料时,乳酸产量可以达到19.8 g/L,转化率为理论最大转化率的85.2%。表1列举和总结了近些年来报道的以秸秆基原料为底物,通过各类微生物细胞工厂以不同发酵方式生产乳酸的情况。

3 秸秆基原料生产乳酸面临的主要问题与挑战

3.1 葡萄糖效应和底物抑制

在大多数微生物中,当葡萄糖和木糖同时存在时,优先利用葡萄糖,当葡萄糖被利用完后才利用木糖,这被称为葡萄糖效应(CCR)。当以秸秆为原料生产乳酸时,葡萄糖效应会增加糖类物质的利用时间,延长发酵时间,不利于乳酸的生产。因此,筛选和构建可以同时利用葡萄糖和木糖的微生物,或开发新型的发酵工艺,对于以秸秆为原料生产乳酸至关重要。研究者在L.plantarum中引入木糖代谢途径,以质量浓度分别为75 g/L的葡萄糖和25 g/L的木糖混合物作为底物,D-乳酸产量达到74.2 g/L,转化率为0.78 g/g,未出现CCR现象[36]。除此之外,使用具有葡萄糖和木糖同时代谢能力的共培养体系进行乳酸发酵,也是应对CCR的一种策略[37]。底物抑制通常发生在糖摩尔浓度(如,六碳糖和五碳糖)较高的发酵过程中,底物摩尔浓度超过临界水平导致菌株被抑制,表现为延迟期变长、渗透压胁迫、水活性降低和细胞裂解。渗透压胁迫会造成细胞功能紊乱,由于糖摩尔浓度的增加,胞内水分会通过渗透作用排出细胞,造成细胞脱水。底物抑制极大减弱了糖的利用,影响整个发酵过程及乳酸生产。因此,克服底物抑制是实现乳酸高效生产的一大挑战。通过筛选和开发耐受高摩尔浓度底物的菌株、优化发酵过程及添加渗透保护剂等方法,可以减弱底物抑制效应[8]。

表1 各类微生物细胞工厂以秸秆基原料生产乳酸Table 1 Lactic acid production with various microbial cell factories with straw as the substrate

3.2 产物抑制

由于发酵过程中乳酸不断累积,会造成系统pH降低,从而影响微生物生长及乳酸的进一步生产。生成的乳酸会渗透进入细胞膜,从而改变细胞膜电势,导致胞内酸化及细胞膜受损,最终导致细胞死亡,被称为产物抑制。通常,在乳酸发酵过程中,培养基pH需控制在5～7之间[18]。因此,在传统乳酸生产过程中,需在培养基中添加碱作为中和剂,将乳酸转化为乳酸盐,以稳定培养基pH。目前,以Ca(OH)2作为中和剂仍是主流方法,然而,该方法会产生大量的副产物——CaSO4(石膏),给生产带来极大负担[2]。为了解决乳酸产物抑制的问题,研究者采用了各种策略。例如,在乳酸产生后,立即将乳酸从培养基中分离掉,被认为是提高乳酸产量的有效方法,而这需要高效的分离技术支撑。将酶和细胞循环的连续同步糖化发酵过程,或将酶和细胞固定化,被认为可以解决反馈、底物和产物抑制问题,有助于提高乳酸产量和摩尔浓度[2]。除此之外,通过菌种突变、筛选、选育和适应性进化等方法,寻找耐受高摩尔浓度乳酸和耐受高渗透压的微生物,可以提高微生物对高摩尔浓度乳酸的耐受性,最终提高乳酸产量。Park等[38]通过核糖体RNA测序法在葡萄皮上筛选到了一株产D-乳酸的耐酸酵母菌株,命名为毕赤酵母Pichiakudriavzevii。该菌株可以在pH为2.0、50 ℃环境下生长。为了进一步将该菌株用于乳酸商业化生产,作者将来源于L.plantarum的D-乳酸脱氢酶基因(d-LDH)替换丙酮酸脱羧酶基因PDC1,其乙醇发酵途径被重新定向。为了进一步提高乳酸耐受性,该菌株被置于高摩尔浓度乳酸的培养基中进行适应性进化,通过全基因组测序,结果证明一种新型的转录调节因子PAR1与乳酸耐受有直接关系。最终的改造菌株,其D-乳酸产量分别为135 g/L(pH为3.6)和154 g/L(pH为4.7),产率分别为3.66和4.16 g/L/h。在酿酒酵母中,Baek等[15]表达外源D-乳酸脱氢酶基因,实现了D-乳酸的生产。之后,通过适应性进化以及表达编码与弱酸应激响应相关的转录激活因子HAA1,提高了该工程酿酒酵母对D-乳酸的耐受性,在不进行中和的条件下,D-乳酸产量达到48.9 g/L。进一步通过多轮适应性进化,该菌株的乳酸耐受性进一步提高,在pH为3.5时,D-乳酸的产量可以提高至82.6 g/L,产率为1.50 g/L/h。

3.3 秸秆水解抑制物耐受

对复杂结构的秸秆进行预处理和水解是取得高乳酸产量的必要条件。然而,大多数的预处理方法均会导致抑制物的产生。预处理过程产生的抑制物主要包括三大类:1)呋喃衍生物;2)弱酸;3)酚类化合物。呋喃衍生物主要包括由己糖和戊糖降解产生的糠醛和5-羟甲基糖醛(HMF),会导致延迟期变长。弱酸主要包括乙酸和甲酸,它们在乙酰基溶解及糠醛和HMF降解过程产生。乙酸和甲酸均被证明会抑制微生物细胞生长,甲酸是最具抑制性的化合物之一[39]。最近的一项研究表明,香豆酸和阿魏酸等酚类化合物在质量浓度超过1 g/L时,显著抑制几种产乳酸微生物的生长[39]。事实上,这些化合物的抑制机制不仅取决于每个化合物各自产生的抑制作用,还取决于它们之间的相互作用和协同作用。因此,在发酵过程中,使用可以稳定耐受抑制物的微生物是实现具有成本竞争力的乳酸生产过程的关键。近年来,许多策略已经被应用至解决秸秆预处理后抑制物释放的问题,例如,筛选在预处理过程释放较少抑制物的秸秆原料、对秸秆水解液进行脱毒处理、采用同步糖化发酵等工艺缓解抑制物毒性、筛选对抑制物具有高耐受性的发酵菌株、通过适应性进化或代谢工程提高抑制物耐受性等[8]。Zhao等[40]分离得到一株乳酸片球菌P.acidilacticiDQ2,可以耐受质量浓度分别为3.0 g/L的HMF、3.6 g/L的乙酸、3.2 g/L的乙酰丙酸。以酸处理和生物脱毒的玉米秸秆作为底物,通过SSF策略,乳酸产量为101.9 g/L,产率为1.06 g/L/h,转化率为0.772 g/g。一株分离的枯草芽孢杆菌Bacillussp.P38可以耐受质量浓度为10 g/L的糠醛和6 g/L的乙酸。在补料发酵中,利用玉米秸秆水解液作为底物,可以生产180 g/L L-乳酸,产率为2.4 g/L/h,转化率为0.96 g/g[41]。Zhang等[42]分离的凝结芽孢杆菌B.coagulansJI12对于抑制物有较好的耐受性,其可以耐受质量浓度分别为12 g/L的乙酸、4 g/L的糠醛,使用SSCF策略,可以转化100 g干小麦秸秆生产46.12 g乳酸。

4 总结与展望

随着生物可降解材料市场的逐渐扩大,聚乳酸材料越来越受到市场的重视和青睐,其生产原料-乳酸的价格和成本成为影响整个行业的重要因素之一。因此,选择合适且廉价的乳酸发酵原料,是实现聚乳酸扩大化生产和应用的关键因素。笔者总结了各类乳酸细胞工厂的构建,以及以秸秆为原料发酵生产乳酸的最新研究进展,重点介绍了乳酸合成代谢途径的重构、乳酸的发酵过程与工艺优化,以及秸秆基原料发酵产乳酸面临的主要问题和挑战。目前,乳酸发酵生产仍然以淀粉基原料为主,虽然以秸秆为原料高效生产乳酸极具前景,但仍然面临许多问题和挑战,如,能量输入高、秸秆预处理酶价格高、微生物糖利用效率低、发酵过程产生不必要的副产物等,这些问题制约着以秸秆为原料生产乳酸的商业化应用。针对这些问题和挑战,笔者提出了相应的解决思路与途径,如图2所示。

图2 秸秆基原料生产乳酸主要问题的解决思路与途径Fig.2 Approaches to solve the problems in the production of lactic acid with straw as raw material

未来的研究将集中在以下几个方面:1)“设计秸秆”,即筛选和评估新型的秸秆原料,目的是筛选预处理后产生较少抑制物,但能产生更多可发酵糖的原料,以减少发酵过程抑制和提高糖共利用效率;2)通过细胞表面展示技术、高效纤维素酶生产基因筛选、纤维素酶分泌菌-乳酸菌混菌发酵等方法改进RCS策略,以期实现直接以秸秆为原料一步转化生产乳酸,降低原料处理和发酵过程成本;3)利用代谢工程和合成生物学方法,筛选、改造和优化微生物全局代谢途径,提高糖利用效率(混菌发酵)和菌株耐受性,获得高产乳酸菌株;4)寻找和开发高效的乳酸发酵工艺和乳酸回收纯化工艺,降低生产过程成本。随着生物技术的进步、整合及合成生物学的发展,以秸秆基原料发酵乳酸,通过乳酸聚合进一步制备生物可降解生物材料,在未来必将大有可为。