生防细菌蜡样芽孢杆菌BCCY-22发酵条件优化

赵 月，杨亚楠，李雅华，赵洪海，咸洪泉

（青岛农业大学生命科学学院，山东 青岛 266000）

0 引言

【研究意义】蜡样芽孢杆菌是一种革兰氏阳性内生芽孢杆菌，常见于土壤和植物中[1]，其中有些蜡样芽孢杆菌可作为生防菌用于防治植物病虫害，发酵条件研究是其开发和应用前提和基础，具有重要意义。【前人研究进展】蜡样芽孢杆菌细胞63 ℃处理2 min死亡率达99.30%[2]，而游离芽孢在70 ℃处理30 min条件下才能将其杀死[3]，蜡样芽孢杆菌产生的芽孢在高温、寒冷等极端环境下具有很强的抗逆性[4]，有利于制剂化，提高制剂的稳定性。蜡样芽孢杆菌能有效防治植物病害，例如蜡样芽孢杆菌强化的生物有机肥可防控细菌引起的烟草青枯病[5]，蜡状芽孢杆菌可抑制植物病原真菌引发的棉花黄萎病并激活天然免疫[6]，防治镰刀菌引起的玉米穗腐和根腐病[7]；蜡样芽孢杆菌还可以防治多种线虫病害[8-11]，同时促进植物生长[12]，对部分抗生素也可产生一定的耐受性[13]。因此蜡样芽孢杆菌是一种具有很好开发前景的生防菌。生防菌开发利用的前提条件是发酵培养，不同生防菌株最适培养条件不同[14]，响应面法是一种高效的微生物发酵培养条件优化方法，可以使用较少的实验数据精准推算出目标值的优化条件[15]。例如Zhang等[16]对谷物孢囊线虫生防菌Trichoderma longibrachiatumT6进行响应面发酵优化，在初始 pH 为6.06、接种量为1.62 mL、孵育时间为7.15 h的条件下发酵培养滤液获得了最高的杀线虫活性。【本研究切入点】本课题组前期筛选出1株对多种植物线虫病害具有良好生防作用的蜡样芽孢 杆 菌 BCCY-22（Bacillus cereusBCCY-22）， 可有效防治小麦孢囊线虫、花生根结线虫和甜瓜根结线虫等线虫病害[17]，具有良好开发前景，然而其发酵培养条件有待深入探讨。【拟解决的关键问题】本研究探讨pH、培养温度、接种量、装瓶量等对生防菌BCCY-22生长的影响，在单因素试验基础上，进行发酵参数响应面优化，筛选BCCY-22菌发酵的最佳条件，旨在为BCCY-22菌株的发酵培养和开发利用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

蜡样芽孢杆菌BCCY-22（Bacillus cereusBCCY-22）由青岛农业大学微生物实验室分离鉴定保存。牛肉膏蛋白胨液体培养基（NA）：牛肉膏5 g·L-1；蛋白胨 10 g·L-1；氯化钠 5 g·L-1，pH 调至 7.2～7.6。

1.2 试验方法

1.2.1 BCCY-22菌株生长曲线测定 将冰箱保存的斜面菌株，NA平板划线活化，挑取一环接种到含有100 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的500 mL锥形瓶中，32.5 ℃，140 r·min-1培养，4 h取样 1次，将样品菌液稀释8倍后，以牛肉膏蛋白胨液体培养基为对照，采用比浊法测定菌液600 nm波长处的吸光值（Optical Density 600，OD600）。将 OD600值以为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制生长曲线。

1.2.2 BCCY-22菌株发酵培养条件的优化 经本实验室前期不同培养基发酵比较试验，发现适宜BCCY-22菌株生长的培养基为NA液体培养基，后续优化发酵培养条件均利用NA液体培养基。

1.2.3 培养温度的优化 接种量为1%，装瓶量20%，发酵培养基初始pH为6.5的条件下，分别置于23.5 、28、32.5 、37、41.5 ℃的振荡培养箱中，140 r·min-1培养3 d，每组3个重复。分光光度计以牛肉膏蛋白胨液体培养基调零为对照，分别在12、24、36、48、60、72 h测定菌液稀释8倍后的OD600值。

1.2.4 发酵培养基初始pH的优化 利用1 mol·L-1的氢氧化钠和盐酸调节牛肉膏蛋白胨液体培养基的初始pH值，将pH值分别设定为5.5、6.5、7.5、8.5、9.5。在接种量1%，装瓶量20%条件下32.5 ℃，140 r·min-1培养3 d，每组3个重复。分光光度计以牛肉膏蛋白胨液体培养基调零为对照，分别在12、24、36、48、60、72 h测定菌液稀释8倍后的OD600值。

1.2.5 接种量的优化 设置接种量分别为1%、3%、5%、7%、9%。装瓶量20%，发酵培养基初始pH为6.5 的条件下，32.5 ℃、140 r·min-1培养 3 d，每组3个重复。分光光度计以牛肉膏蛋白胨液体培养基调零为对照，分别在12、24、36、48、60、72 h测定菌液稀释8倍后的OD600值。

1.2.6 装瓶量的优化 设置装瓶量分别为10%、20%、30%、40%、50%。接种量1%，发酵培养基初始pH为6.5的条件下， 32.5 ℃、140 r·min-1培养3 d，每组3个重复。分光光度计以牛肉膏蛋白胨液体培养基调零为对照，分别在12、24、36、48、60、72 h测定菌液稀释8倍后OD600值。

1.2.7 发酵培养条件的响应面优化设计试验

（1）选取对生物量影响较大的3个因素：温度、pH、装瓶量。

（2）利用minitab软件，采用中心复合设计（Central composite design，CCD)进行响应面试验优化发酵条件，中心符合序贯设计（Central composite circumscribed design）确定试验因素和水平（表1）。

表1 试验因素水平Table 1 Factor level of optimization experimentation

1.2.8 发酵时间的优化 在上述优化的发酵条件基础上发酵培养，分别在 6、12、24、36、48、60、66、72 h测定菌液生物量，确定最佳的发酵时间。

1.2.9 差异显著性分析 采用DPS v7.05软件使用Duncan’s新复极差法进行因素多重比较分析，多个处理间的显著性差异水平P＜0.05时为差异显著，Excel进行数据整理并制图。

2 结果与分析

2.1 生长曲线的测定

菌株BCCY-22在4~12 h快速增长，为对数生长期（图1），因此选取对数生长期的菌体（10 h）作为后续试验的种子液。

2.2 发酵条件优化结果

2.2.1 培养温度的优化结果 在23.5～37.0 ℃，培养36 h以内，BCCY-22菌体量差异不显著，说明BCCY-22生长适宜温度范围较宽；32.5 ℃培养48 h时，BCCY-22培养液OD600显著高于其他温度下培养液OD600，菌体量最高；随着培养时间的增加，在37.0 ℃和41.5 ℃较高温度培养下，菌体不稳定，数量下降（图2）。综合生长速率和生物量指标，BCCY-22适宜的培养温度范围为23～32.5 ℃。

2.2.2 发酵培养基初始pH的优化结果 菌株BCCY-22在初始pH为5.5培养基中，菌体生长缓慢，60 h时，菌体量达到最大，之后OD600值开始下降，在初始pH为6.5的培养基中，生长较快，培养48 h达到稳定期，生物量最大。培养基初始培pH值6.5和7.5，60 h内BCCY-22培养液OD600不显著；培养基初始pH值为8.5和9.5时，培养24 h对BCCY-22生长无显著影响（图3）。综合培养基初始pH对菌株BCCY-22影响，BCCY-22菌株在初始pH为6.5的培养基中生长较快，有利于获得最大的生物量。

2.2.3 接种量的优化结果 接种量对菌体生长有一定影响，在24 h内，接种量为3%时BCCY-22的菌体数量显著高于其他处理组；培养至36 h，BCCY-22的菌体数量接种量为3%和1%差异不显著，但显著高于其他处理组（图4）。综合考虑生长速率和生物量指标，接种量以3%为宜。

2.2.4 装瓶量的优化结果 在所有的处理组中，当装瓶量为10%时，培养12 h的菌体数量显著高于其他处理组；培养24 h时，装瓶量为10%和20%两者之间的菌体数量差异不显著，但是显著高于其他处理组，此时菌体数量最多；说明装瓶量少，有利于菌体数量的快速增加（图5），BCCY-22菌株对氧的需求较高。

2.3 发酵条件响应面试验设计优化结果分析

响应面试验结果见表2，利用统计软件Minitab对试验数据进行二次多项回归拟合。多项式模型方程拟合的性质由确定系数R2（R-Sq）表达，其统计学上的显著性由F检验确定。通过的RSREG（响应面回归）过程进行数据分析，建立二次响应面回归模型。结果表明，R-Sq=86.48%，R-Sq（预测）=11.52%，R-Sq（调整）=74.31%，说明经过调整后该模型能解释74.31%的变化。表3为二次多项式回归方差分析表，回归、线性以及平方的P值小于0.05，模型失拟检验的P值大于0.05，说明回归模型正确，不需要对回归模型做出调整。表4为二次多项式回归系数及其显著性检测结果，模型方程A、C、A2、C2、A与C、A与B以及B与C项的P值大于0.05，B、B2的P值分别为0.000、0.003，说明在这3个因素中，温度以及装瓶量对OD600值影响不显著，培养基的初始pH对生物量影响显著，并且3个因素之间交互作用不明显。

表2 中心复合设计及试验结果Table 2 Design and results of experiment

表3 二次多项式回归方差分析Table 3 Quadratic polynomial regression variance test results

表4 二次多项式回归系数及其显著性检验Table 4 Quadratic polynomial regression coefficient and significance test

可以用以下回归方程表示三个因素与生物量之间的关系：Y=-4.248 9+0.186 9A+0.804 9B+0.015 7C-0.003 1A2-0.044 7B2-0.000 2C2-0.007 0AB-0.000 2AC-0.000 3BC，其中A代表温度、B代表培养基的初始pH、C代表装瓶量。

pH、温度的交互作用对OD600的响应曲面见图6、7，当温度一定的时，pH为2～6时，随着pH的增加，生物量也随之增加，变化较明显；pH为6～8时，生物量变化不明显。当pH一定时，温度对生物量的影响不明显。

温度、装瓶量的交互作用对OD600的响应曲面见图8，当装瓶量一定时，随着温度的上升，生物量增加，但是当温度超过25 ℃左右时，生物量开始下降。当温度一定时，随着装瓶量的增加，生物量增加，装瓶量超过40%左右后，生物量随着装瓶量的增大而减小。温度、装瓶量的交互作用对OD600的等值线见图9，当装瓶量为40%时，温度在20～26 ℃时，生物量可以达到0.8以上。

pH、装瓶量的交互作用对OD600的响应曲面见图10，当pH一定时，装瓶量对生物量影响不明显时。当装瓶量一定时，随着pH的上升，生物量增加，但是超过一定的pH时，生物量开始下降。pH、装瓶量的交互作用对OD600的等值线见图11，相较于装瓶量，培养基的初始pH对生物量影响明显。

通过对回归方程分析当培养温度为21.33 ℃，培养基的初始pH为7.27，装瓶量为23.13%时可得到响应最大值。为了方便操作，培养温度取21.5 ℃、培养基的初始pH为7.3、装瓶量为23%，在此条件下重复3次试验，此时培养基的OD600值为0.99。通过试验证明，在这种条件下培养，菌体培养36 h后的OD600值为0.987，为理论预测值的99.70%，说明响应面模型可靠，为BCCY-22菌株的发酵提供了理论依据。

2.4 发酵时间的优化

发酵条件优化前，细菌生长较慢，发酵42 h进入稳定期，生物量达到最大，OD600=0.768；优化发酵条件后，细菌生长迅速进入对数生长期，在36 h时达到生物量最大，OD600=1.044；进入稳定期（图12）。所以在优化的培养条件下，发酵时间以36 h为宜。蜡样芽孢杆菌BCCY-22优化发酵后，缩短发酵时间6 h，生物量是优化前的135.94%。

3 讨论与结论

蜡样芽孢杆菌在自然界分布广泛，是一种兼性厌氧或好氧的革兰氏阳性菌[18]，是土壤微生物的重要组成部分[19]，其在植物根际土壤具有快速定殖的特征，可通过抑制病原菌的侵染和定殖来进行生物防治[20]；蜡样芽孢杆菌具有超强的抗逆性，抵御外界不良因子和较强的环境适应能力与它产生的芽孢有关，芽孢在休眠期间可在酸碱环境、高温等环境存活[21]。目前芽孢杆菌被广泛应用于生物防治[22]，成为目前生防菌研究的重要对象。众多研究表明，通过对生防菌培养条件和培养基成分的优化，可提高其生物量或促进生物活性物质产生，从而提高生防效果[23,24]。朱海云等[25]对抗猕猴桃细菌性溃疡病蜡样芽孢杆菌MA23进行发酵条件优化，确定了蜡样芽孢杆菌MA23最佳发酵初始pH6.5、最佳发酵温度为30 ℃、最佳接种量为8%、最佳摇床转速为180 r·min-1；Chen等[26]对以富硒为有机硒源的蜡样芽孢杆菌进行发酵工艺优化研究，结果表明，最佳发酵条件为接种量7%、发酵温度33 ℃、摇床转速170 r·min-1；尹艳楠等[27]对蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株进行响应面发酵优化，结果表明，最佳发酵条件为温度28 ℃、发酵初始pH值7.5、接种量为2%、装液量30%。上述一系列研究结果表明，不同蜡样芽孢杆菌的最佳培养条件不同。

生防细菌菌株蜡样芽孢杆菌BCCY-22对多种农作物线虫病害具有防治效果，本研究单因素试验结果表明，温度、pH和装瓶量对蜡样芽孢杆菌BCCY-22菌株的生物量影响较大。通过响应面试验结果分析和试验验证：生防细菌BCCY-22最佳发酵条件为发酵温度21.5 ℃、初始pH 7.3、种子液接种量3%、装瓶量23%、发酵时间36 h；比优化前发酵时间缩短了6 h，生物量是优化前的135.94%。对比不同蜡样芽孢杆菌最适发酵条件，蜡样芽孢杆菌BCCY-22的发酵温度较低，这可能由于是菌株差异造成的，BCCY-22菌株最初是以小麦孢囊线虫病为靶标筛选的生防菌，小麦孢囊线虫侵染植物以春季孵化的二龄幼为主[28]，此时温度较低，蜡样芽孢杆菌BCCY-22可在较低的温度快速生长繁殖，可能更有利于蜡样芽孢杆菌BCCY-22发挥其生防潜能。本研究为蜡样芽孢杆菌BCCY-22生物防治发酵产品开发奠定基础。