温度诱导斑点叉尾鮰雌性化研究

徐思琪，张世勇 ，张文平，刘洪岩，王明华，钟立强，边文冀,3，陈校辉,3

（1.江苏省淡水水产研究所，江苏 南京 210017；2.江苏海洋大学海洋科学与水产学院，江苏 连云港 222005；3.江苏省农业种质资源保护与利用平台，江苏 南京 210014）

0 引 言

【研究意义】斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus），属鲶形目（Siluriformes）鮰科（Ictaluridae），原产于北美，是美国最主要的淡水养殖品种，养殖产量占美国鱼类养殖产量的60%以上[1]。自1984年我国首次从美国引种，经过三十多年的发展，在广东、河南、江苏、湖北、四川等省份形成较大的养殖规模。随着我国斑点叉尾鮰市场需求量的不断扩大，其养殖产量呈逐年递增的趋势。自2013年起，我国的斑点叉尾鮰养殖产量超越美国，成为世界最大的斑点叉尾鮰养殖和消费国家[2]。相较于斑点叉尾鮰雄鱼，雌鱼生长较为缓慢，且较大的卵巢组织一定程度上降低了其可食用比例，因此雄鱼在流通市场上更受欢迎。性别二态性是自然界中的常见现象。在鱼类中，大多数种类由于存在生长、性成熟年龄、体型、体色等性别二态性现象，使得其中的一种性别具有更大的经济价值，雌雄个体经济价值的不同在一定程度上制约了其产业的发展。因此，越来越多的育种工作者开始探索性别控制育种，培育具有更大经济价值的单性品种。在斑点叉尾鮰全雄鱼的选育过程中，获得稳定遗传的XY伪雌鱼是最为核心的环节。为此，课题组以培育斑点叉尾鮰全雄品种为目标，着力开展温度诱导其XY型雄鱼雌性化研究。在伪雌鱼性成熟后，通过与正常雄鱼杂交或采用雌核发育策略获得YY型超雄鱼，超雄鱼再与正常雌鱼杂交即可培育出全雄鱼。【前人研究进展】大量研究表明温度的升高或降低可以诱导硬骨鱼类雌性化或雄性化。遗传性别为雌性的奥利亚罗非鱼（Oreochromis aureus）[3]在高温诱导后生理性别向雄性方向逆转，在大鳞副泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）[4]、斑马鱼（Danio rerio）[5]、尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）[6]、牙鲆（Paralichthys olivaceus）[7]、黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）[8]等也发现高温可使雄性率升高的现象。银汉鱼（Menidia beryllina）[9]在低温条件下雌性率可达85%。在小黄鱼（Larimichthys polyactis）[10]养殖过程中发现，温度升高能使小黄鱼性腺分化速率加快，同时小黄鱼的生理性别为雌性的比例升高。在少量的鱼类中，也观察到高温诱导雄性向雌性逆转的现象，高温促使鲫鱼（Carassius auratus）[11]、许氏平鲉（Sebastes schlegeli）[12]、江黄颡鱼（Pseudobagrus vachelli）[13]等的生理性别向雌性化方向分化。【本研究切入点】在上述研究基础上，本项目组前期试验发现在斑点叉尾鮰中通过提高温度能够使其性腺向雌性化方向分化发育，这为斑点叉尾鮰的性控制研究提供了新的思路。斑点叉尾鮰的卵巢分化起始于受精后的第19 d，而精巢的分化晚于卵巢，一般在受精后的第90～102 d开始[14]。在斑点叉尾鮰的卵黄囊苗时期提高养殖水体温度，可以诱导斑点叉尾鮰向雌性化方向分化。【拟解决的关键问题】本试验通过比较不同温度处理组生长数据，并利用组织学切片技术观察其性腺分化与发育情况；同时，采用qRT-PCR方法分别检测雄性性别标志基因dmrt1 基因和雌性性别标志基因 foxl2 基因在 XX 和XY伪雌鱼卵巢中的表达水平，探究温度对斑点叉尾鮰生长及性腺分化的影响及不同温度对性腺分化影响的潜在机制，为阐明温度影响斑点叉尾鮰分化机制奠定基础，同时为日后建立环境友好型的斑点叉尾鮰性别控制育种模式提供前期探索。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所选用的斑点叉尾鮰亲鱼来自国家级江苏斑点叉尾鮰遗传育种中心。健康亲鱼交配产卵后，选取发育成熟、活力旺盛的卵黄囊苗，在斑点叉尾鮰鱼卵流水孵化装置中孵化出苗。设置（30±0.5） ℃（T-30，CK）、（33±0.5） ℃ （T-33）和（36±0.5） ℃（T-36） 3个温度组，初始水温为28 ℃，使用加热棒每隔12 h升温1 ℃，至水温到达设定温度后持续保持温度恒定。每个试验组设置3个重复，每个重复放置800尾鱼苗（规格：52 尾·g-1），从1 dah斑点叉尾鮰的培育开始，进行为期30 d的温度诱导试验。待卵黄囊褪去，仔鱼上游觅食后，先投喂开口饵料，然后投喂微粒饲料（粗蛋白≥50%，粗脂肪≥8%，粗纤维≤3%，粗灰分≤16.5%，钙≤5%，总磷≥1%，水分≤12%，赖氨酸≥2%）（山东升索饲料科技有限公司），根据试验鱼的生长情况制定的开口饵料及微粒饲料调整方案如表1所示。结束30 d的温度诱导后将30日龄试验鱼移至室外水泥池（5 m×5 m×1 m）进行养殖，饲料更换为商品饲料（粗蛋白≥30%，水分≤12%，粗纤维≤10%，粗灰分≤13%，粗脂肪≥3%，总磷≥1%，赖氨酸≥1.5%）（南京市澳华生物科技有限公司）。每日上、下午各投喂一次，日投喂量为鱼体重的3%。

表1 开口饵料及微粒饲料调整方案Table 1 Particulate feed adjustment for channel catfish

1.2 生长数据采集

在60日龄时，采用-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐（MS-222）（Merck，德国）浸润麻醉，统计各组中试验鱼的存活情况，从各试验组中随机选取100尾试验鱼，测量试验鱼的体长、体重生长数据。

1.3 遗传性别鉴定

在60日龄时，从各试验组中随机选取20尾试验鱼，剪取试验鱼的尾鳍后，将其保存在无水乙醇中，用于遗传性别鉴定。取10～20 mg的尾鳍组织，擦干剪碎后放置于1.5 mL离心管中。基因组DNA的提取采用DNA Isolation Mini Kit试剂盒（南京诺维赞生物科技有限公司），提取过程严格按照说明书进行，提取完成的基因组DNA样本存放于-20 ℃冰箱中保存。采用课题组前期开发的斑点叉尾鮰遗传性别鉴定方法[15]对试验鱼的遗传性别进行鉴定。

1.4 解剖学观察

在60日龄时，从各试验组中随机采集100尾试验鱼，麻醉后割断鳃盖与腮丝间的动脉，血液放干后在试验鱼的肛门处做纵向切口，根据试验鱼规格调整切口长度（约3～4 cm），观察试验鱼卵巢形成情况。同时，采集试验鱼的尾鳍组织，提取DNA后鉴定遗传性别。根据鉴定结果统计各组中试验鱼的卵巢形成比例和性逆转率（XY伪雌鱼/XY雄鱼×100%）。

1.5 组织学观察

取性腺保存在多聚甲醛溶液中，用于组织切片。性腺组织中的蛋白质经多聚甲醛保存后变性凝固，用低浓度到高浓度的酒精脱去性腺组织中的水分，置于二甲苯中透明后浸入融化的石蜡中，待石蜡浸入完全后进行包埋冷却。制作5～6 μm的切片，采用HE染色，最后滴上树胶封固[16]。在光学显微镜（Nikon，日本）下观察并拍照记录各试验组中性腺形成情况，在组织学水平观察T-30组中正常雌鱼，T-33组、T-36组中XY雌鱼的性腺发育情况。

1.6 性别分化相关基因表达分析

采用qRT-PCR方法检测T-30组、T-36组雌雄性腺中foxl2和dmrt1基因mRNA的相对表达量。采集150日龄T-30组雌雄试验鱼的精巢、卵巢组织，T-36组正常雌鱼和XY雌鱼的卵巢组织后，使用RNA提取试剂盒（Qiagen，德国）提取总RNA，该过程严格按照说明书进行。使用Prime ScriptTMRT Master Mix试剂盒（TaKaRa，日本）合成cDNA，cDNA合成后存放于-80 ℃冰箱。应用NCBI中Primer-BLAST功能设计斑点叉尾鮰foxl2和dmrt1基因编码区的qRTPCR反应引物，内参基因为α-tubulin[17]，qRT-PCR反应引物如表2所示。qRT-PCR体系为 25 μL，包括12.5 μL TB Green 染 料 （Takara， 日 本 ）， 2 μL cDNA，上下游引物各 1 μL，5 μL H2O。qRT-PCR 程序为 95 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，57 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，79 ℃ 5 s，95 ℃ 15 s，每个试验 3 次重复。采用 2-△△CT值法[18]计算foxl2和dmrt1基因在正常XX雌鱼、XY雌鱼卵巢中的相对表达量。

表2 qRT-PCR反应引物表Table 2 Primers for q-PCR

1.7 数据分析

使用Excel软件统计生长、存活率和性逆转率等数据，试验数据以“平均值±标准差 （X ±SD） ”表示，采用R 4.0.5软件对所有试验数据进行单因素方差分析（one-way ANOVA）。

2 结果与分析

2.1 温度对斑点叉尾鮰生长及性逆转的影响

统计T-30组、T-33组和T-36组60日龄试验鱼的生长情况及卵巢形成情况发现（表3），温度越高，试验鱼的存活率越低，当温度达到36 ℃时，试验鱼的存活率仅为82.67%，与其他两组呈显著性差异（P＜0.05）。T-33组试验鱼的体长、体重均为3组中最高，T-36组试验鱼的体长、体重均为3组中最低，但是3组处理之间的生长数据无显著性差异（P＞0.05）。T-30组卵巢形成比例为51%，雌雄鱼比例接近1:1，随着温度的提高，试验鱼的卵巢形成比例逐渐提高，性逆转率与温度呈正相关。各组在卵巢形成比例和性逆转率均呈显著性差异（P＜0.05）。

表3 试验鱼生长特性和雌鱼比例Table 3 Growth and survival of channel catfish and proportion of females in each experimental group

2.2 性逆转效果评估

性逆转效果评估是在鉴定试验鱼遗传性别后，根据组织学观察和解剖学观察综合分析XY雌鱼卵巢发育情况（图1）。选取T-30、T-33组、T-36组XX雌鱼和T-33组、T-36组XY伪雌鱼的卵巢组织进行对比分析，结果发现各组的卵母细胞均呈圆形，都以Ⅱ期卵母细胞为主，T-30组XX雌鱼的部分卵母细胞发育至Ⅲ期卵母细胞，而T-33组、T-36组中XX雌鱼的卵母细胞以Ⅲ期卵母细胞为主，T-36组XY伪雌鱼中存在少量Ⅲ期卵母细胞，而T-33组XY伪雌鱼中未见明显的Ⅲ期卵母细胞。T-33组和T-36组XY伪雌鱼的卵母细胞数量少于XX雌鱼，且细胞内以1～2个核仁的卵母细胞为主，T-30组、T-33组和T-36组的卵母细胞核内主要分布3个以上核仁。

通过解剖学观察发现，T-30组、T-33组和T-36组之间卵巢发育无异，T-36组中XY雌鱼的卵巢发育正常，但T-33组中XY雌鱼的卵巢发育缓慢，卵巢纤细，且与体腔黏膜相连，轮廓不清晰。

2.3 温度对性别分化相关基因表达量的影响

对150日龄T-30组中雌鱼、雄鱼的卵巢和精巢组织，以及T-36组中XY伪雌鱼和XX雌鱼卵巢组织提取总mRNA后，通过qRT-PCR方法检测雄性性别决定基因dmrt1和雌性性别决定基因foxl2在上述组织中的相对表达量（图2）。结果显示，dmrt1基因在正常雄鱼的精巢中的表达量最高，与T-30、T-36组中雌鱼的卵巢组织的表达量呈显著差异（P＜0.05），与T-36组中XY伪雌鱼的卵巢组织无显著性差异。foxl2基因在T-36组XY雌鱼中被激活，与T-36组雌鱼，T-30组正常雌鱼、雄鱼的性腺组织呈显著性差异（P＜0.05）。

3 讨论

硬骨鱼的性别分化和形成由遗传因素和环境因素共同决定，环境因素包括温度[19]、pH值[20]、光周期[21]、溶解氧[22]、种群密度[23]等，具有很强的可塑性[24]。其中，温度是影响硬骨鱼性别分化的最重要环境因子[25]。高温时，硬骨鱼的性别决定出现温度依赖型，即温度阈值达到34 ℃时，硬骨鱼的性别分化向雌性或雄性的方向逆转[26]。硬骨鱼发育早期，高温通过改变体内芳香化酶活性，导致雌雄鱼体内分泌的雌二醇、睾酮等相关性激素含量出现差异，最终改变原有的性别分化方向[27]。在已报道的大部分硬骨鱼类中，高温通常诱导其性别比例偏向于雄性[28]，本试验中斑点叉尾鮰在高温诱导下性腺向雌性化方向分化，与鲫鱼[11]、许氏平鲉[12]等分化方向相同。

研究表明，对于广温性鱼类和暖水性鱼类而言，当养殖水体温度超过最适水体温度时，其代谢加快，饵料系数降低，鱼体生长减慢[29]。但是不同鱼类适宜的养殖水体温度略有差异，刘鉴毅等[30]研究表明，当水温在19～31 ℃时，斑点叉尾鮰的特定生长率（SGR）和相对增重率（WGR）与温度呈正相关，并基于研究推断31 ℃并未达到斑点叉尾鮰的最适生长温度。在本试验中，T-33组试验鱼的生长数据最佳，这可能与33 ℃更贴近斑点叉尾鮰的最适生长温度有关。

foxl2和dmrt1基因被认为是硬骨鱼类雌雄性别分化的标志基因，其在性别决定和分化中互为拮抗作用，foxl2基因对卵巢的分化和促进卵母细胞的发育有着重要作用，而dmrt1基因主要参与雄性的性别决定和精巢的分化，抑制卵母细胞发育[31]。foxl2和dmrt1基因通过调控cyp19a1、sox9等下游性别分化相关基因的表达，使雌雄硬骨鱼体内雌二醇和睾酮等类固醇激素含量出现差异[32,33]，从而达到调控雌雄性别分化的目的。研究发现，dmrt1基因对雄性斑马鱼的性腺维持起着重要作用，dmrt1基因的突变会导致雄性斑马鱼性逆转为可育雌性[34]；使用CRISPR/Cas9技术敲除异育银鲫（Carassius gibelio）foxl2基因，导致其卵母细胞发育缓慢甚至发生性逆转[35]。

在本研究中，foxl2基因在XY伪雌鱼卵巢中的表达量显著高于其他3个组织，造成这一现象的可能原因是高温通过上调XY伪雌鱼foxl2基因的表达实现其性别逆转。然而，XY伪雌鱼的dmrt1基因在卵巢中的表达量仅低于正常雄鱼精巢，其表达并没有完全被抑制。类似的现象也见于17β-雌二醇诱导尖吻鲈（Lates calcarifer）性逆转的研究中，其性逆转鱼卵巢中foxl2基因的表达量显著上调，但dmrt1基因的表达未被完全抑制[36]。因此，推测即使XY雌性斑点叉尾鮰dmrt1基因虽未被完全抑制，但是受高表达foxl2基因的影响，其性腺仍旧会发育成卵巢。然而，高温诱导解除后，其性腺是否会向精巢分化仍有待于进一步研究。