天然低共熔溶剂萃取酚类物质研究进展

张艺欣 邬旭然 何若菡 冯 硕 杨丰旗

(烟台大学生命科学学院，山东 烟台 264005)

天然低共熔溶剂(NADES)是由糖类、有机酸、氨基酸和胆碱衍生物等天然化合物按一定摩尔比组合后在一定条件下形成的低熔点液态混合物，其形成原理为氢键供体(HBD)与氢键受体(HBA)之间形成的氢键使电荷离域，导致混合物熔点降低，最终在室温下呈现液态的共晶体系[1]。Choi等[2]提出除水和脂质外，细胞内存在第三液相，即由糖、醇、氨基酸、胆碱衍生物相互作用形成的NADES。生物体内NADES的存在可以解释多种生物现象，如在细胞水环境中有难溶于水的代谢物的合成；一些植物可在极端条件下生存等。某些植物汁液如花蜜和枫糖浆，也被认为是天然存在的NADES[3]。NADES具有制备简单、易降解、毒性低[4]等优点，因而通常作为催化剂和萃取溶剂被应用于分析化学和生物化学领域，尤其是活性物质的提取和分离研究。

酚类物质是一类重要的植物次生代谢物。常用于萃取酚类物质的溶剂为甲醇或乙醇，此类有机溶剂毒性高、易燃，而且提取过程中试剂消耗较多，易造成环境污染。NADES具有生物相容性、可调性、环境友好等优势，被认为是取代传统有机溶剂的最佳替代品[4]。NADES超分子结构上的羟基或羧基可与酚类化合物形成氢键，增加提取产量，同时氢键的形成可提高酚类物质的稳定性[5]。一项研究[6]表明NADES中的许多酚类物质可以保持稳定长达60 d。文章拟对NADES用于酚类物质提取的相关研究进行综述，并总结影响提取效率的主要因素和产物回收的方法，以期为开发天然的酚类萃取溶剂提供参考。

1 NADES在酚类物质提取中的应用

NADES可以分为5类:由酸和碱合成的离子液体型；糖类或糖和多元醇合成的中性型；糖或多元醇与有机酸合成的中性酸型；糖或多元醇与有机碱合成的中性碱型；氨基酸和糖或有机酸合成的氨基酸型[7]。氯化胆碱(ChCl)属于B族维生素之一，是最经济的胆碱合成形式，可作为大宗化学品大规模生产。ChCl的生物相容性较高，是目前常用的HBA[8]。根据酚类物质的化学结构可分为几个亚组，包括黄酮类和酚酸类，以及姜黄素、木质素等其他多酚。近年来，众多研究人员以不同基质材料为研究对象，应用NADES探究酚类物质的高效绿色提取方法。

1.1 黄酮类化合物

芦丁是一种常见的膳食糖基类黄酮，Faggain等[9]报道，由谷氨酸/脯氨酸(摩尔质量比为2∶1)和脯氨酸/ChCl(摩尔质量比为1∶1)组成的NADES能有效溶解芦丁。Huang等[10]研究表明，超声波与NADES萃取相结合的方法可高效地从苦荞壳中提取芦丁；芦丁在13种氯化胆碱和甘油基NADES中的溶解度比在水中的提高了660～1 577倍，当ChCl/Gly含水量为20%时，提取率最高为9.5 mg/g，提取率为95%。此外，该研究还对NADES的毒性和生物降解性进行了评价，发现NADES溶剂毒性极低，28 d后生物降解率为70%，可被归类为易生物降解溶剂。

花青素属于黄酮类化合物，是一种强效的自由基清除剂。研究[11]表明，花青素可抗氧化损伤，预防动脉粥样硬化、阿尔兹海默症等疾病。Da Silva等[12]建立了一种环保、低成本的蓝莓花青素提取方法，以ChCl/甘油/柠檬酸(摩尔比0.5∶2∶0.5)的三元NADES作溶剂，提取率约为76%。该研究小组[13]制备了总酚质量浓度为1.1 mg/mL 的蓝莓提取物-NADES溶液进行大鼠喂养试验，代谢动力学分析显示CE-NADES通过延缓胃糜中和，提高了体内消化过程中酚类化合物的稳定性。Popovic等[4]研究发现花青素在酸性介质中稳定性较高，在以ChCl为HBA，苹果酸、尿素、果糖为HBD的3种溶剂体系中，40 ℃加热搅拌，ChCl/苹果酸体系的樱桃果渣提取物中花青素的含量较高，而微波辅助方法提取速度快，时间小于5 min。但基于苹果酸的NADES体系pH值过低，提取物的抗自由基活性较差。

Oomen等[14]研究发现4种含有柠檬酸的亲水性NADES均能提取黄岑中的黄酮化合物，采用高效液相色谱法和高效薄层色谱法对提取物的化学成分进行定量分析，发现NADES中黄岑素类苷元含量是甲醇水溶液的3～5倍，相应糖苷含量为甲醇水溶液的1.5～1.8倍。熊苏慧等[15]使用NADES提取玉竹中的总黄酮，得到的最大提取率达18.79 mg/g，经大孔树脂吸附后NADES可被二次使用，回收利用率为94.56%。

1.2 酚酸及其他多酚

酚酸是一类常见的非类黄酮植物多酚，具有良好的抗氧化、抗菌活性，主要来源于水果、蔬菜、种子、芳香植物等。Juric等[16]评价了6种ChCl基NADES对薄荷叶多酚的提取效率，发现山梨醇/ChCl体系提取物中羟基肉桂酸含量较高，以有机酸为HBD的两种NADES对酚酸的萃取能力优于其他NADES。此外，体外抗氧化试验结果表明，6种NADES提取液的DPPH自由基清除能力均优于70%乙醇，这可能是由于体系中的氢键提高了酚类化合物的稳定性。郁峰等[17]研究发现从杜仲叶中提取绿原酸的较优溶剂体系为甜菜碱/L-乳酸/水(物质的量比为1∶1∶4)，萃取条件优化后的绿原酸得率为31.46 mg/g，提取物对 DPPH·、ABTS·和·OH 均有较强的清除能力。

Alsaud等[18]提出了一种疏水型低共熔溶剂，将薄荷醇与乳酸按摩尔比1∶2混合得到的溶剂可从麦卢卡叶片中同时提取两种极性差异较大的活性物质：半萜烯类和酚类，提取物总酚含量低于传统溶剂乙醇，但其抑菌效果优于传统溶剂。Doldolova等[19]制备了以ChCl、乳酸、果糖和蔗糖为溶剂原料的5种二元组合NADES，利用微波辅助(MAE)从姜黄中提取姜黄素，采用响应面法对MAE参数进行优化，发现温度是影响姜黄素提取的最重要因素。优化萃取条件后,采用铜离子还原能力法(CUPRAC)对提取物最大总抗氧化能力(TAC)进行测定，除果糖/ChCl外，其余NADES提取物TAC均高于80%甲醇。

综上，基质材料所含酚类化合物类型各不相同，选择合适的NADES种类，调节氢键供体与受体比例，并优化萃取条件，可取得较好的提取效果。更多应用举例总结于表1。

2 NADES提取酚类物质的影响因素

2.1 NADES组成及摩尔比例

NADES组分和组分之间的摩尔比例决定了共晶体系的液态稳定性。氢键受体与供体基团数量、空间结构和键的位置均对NADES的形成有显著影响。若组分中有额外的羟基和羧基存在，则分子间可以形成更多氢键，易形成稳定性较高的共晶体系。如琥珀酸不能与胆碱形成液体，但含羧基较多的柠檬酸和苹果酸可以。若组分之间的摩尔比例不当，NADES会出现固体结晶。高黏度是NADES的重要特征，但黏度过高不利于传质，不仅会降低提取效率，还会影响酚类提取物的分离纯化。分子大小和组分之间的相互作用力是影响共晶体系黏度的主要因素，如含有一个羧基的乳酸基NADES，黏度低于含3个羧基的柠檬酸基NADES；小分子的多元醇基溶剂黏度低于糖或有机酸基溶剂[30]。短小结构或多羧酸结构的HBD更容易与多酚靶标化合物相互作用，使提取产量增加。

HBA与HBD的性质决定了NADES的极性及pH值。溶剂极性是影响萃取效率的最重要因素，NADES极性越接近目标物，提取可能性越高。NADES极性范围广泛[2]，有机酸基NADES表现出与水相近的高极性，氨基酸和醇基NADES次之[31]。NADES的pH值是影响提取效率的另一因素，当溶剂pH值略低于酚类物质的pKa，酚类化合物在溶剂中处于中性状态时更容易被提取。酸基NADES对花青素、儿茶素和绿原酸表现出较高的提取亲和力[7,16]。

受体与供体比例也会影响酚类物质与溶剂组分之间形成氢键。NADES乳酸百分比为35%时，提取物呈现出最高的TPC，乳酸比例升高至75%时，提取量下降。相比乳酸阴离子，酚类物质更容易与氢受体键中胆碱季阳离子形成氢键，系统中添加过多乳酸，会削弱目标物与胆碱之间的氢键作用，乳酸相对于胆碱含量越多，酚类物质的提取量就越少[26]。

2.2 NADES水分含量

NADES的含水量会通过影响共晶系统的黏度从而影响提取效率。在NADES制备过程中加水或制备后提取前用水稀释NADES可降低体系黏度，有利于萃取过程中更好地传质。水分含量还会影响NADES的极性，通过添加特定量的水使NADES溶剂极性与目标提取物相似，就可以实现最佳的萃取效率。过量的水会削弱NADES分子间的氢键结构，通常加水量为20%～50%[31]。每一种提取方法的变量不同，因此需要根据实际组分与基质材料的性质确定最优含水量。

表1 NADES用于酚类物质提取

2.3 其他因素

2.3.1 萃取温度 通常NADES黏度随温度升高而降低，当温度升高时，分子自由运动，NADES组分间的氢键作用和范德华力减弱，体系黏度下降。适当提高萃取温度可促进生物质细胞的渗透以及溶剂与目标化合物之间的相互作用，能够使目标物更快地扩散到溶剂中。酚类物质多为热敏性的，理想萃取温度为25～60 ℃。

2.3.2 辅助提取方法 目前常用的辅助方法有超声辅助(UAE)、微波辅助(MAE)、加热搅拌(H&S)等。UAE是通过空化作用，增加溶剂穿透力，加速提取过程，提高提取量[32]；MAE具有提取时间及短，溶剂消耗少等优势。UAE和MAE的设备功率、提取时间等都是影响提取效率的重要因素。

2.3.3 液固比 液固比是容易对提取率产生负效应值的一个变量，过量的溶剂会增加介质中的溶氧量，增加酚类物质的氧化；液固比过低时，过量的固体导致溶剂饱和，不利于传质[26]。

3 酚类物质的回收及溶剂的重复利用

NADES作为合成溶剂，成本相对较高，溶剂的回收是十分必要的。反溶剂法、大孔树脂吸附和固相萃取是近几年常用的从提取液中分离目标物的方法。反溶剂法操作相对简单，在提取液中添加反溶剂，稀释的NADES与目标化合物间的氢键网络断裂，离心后酚类物质形成沉淀与溶剂分离；上层富溶剂相可通过减压蒸馏等方法实现再生。Huang等[10]研究发现，水是测试溶剂中最有效的抗溶剂，芦丁回收率为95.1%，回收后ChCl/Gly的3次再萃取效率分别为原溶剂的92%,87%,81%。20倍的水作为反溶剂，可分离提取液中的姜黄素[2]。Mamilla等[33]选用丙酮作为反溶剂，从提取液中分离木质素、木纤维素，DES以固体状态被回收。

Tian等[34]提出了一种从低共熔溶剂(DES)中回收黄酮类化合物的新策略，向体系中加水稀释到10%，然后加入一种铬金属有机框架MIL-100 (Cr)，使目标化合物吸附在MIL上实现目标物与溶剂的分离。

树脂吸附法是一种简单有效的活性物质回收方法，利用大孔树脂吸附酚类物质，NADES极性成分用水洗脱。Zhang等[35]研究发现AB-8树脂具有较高的吸附/解吸性能，刺五加总黄酮类化合物的回收率高达(71.56±0.256)%，DES溶剂可以有效地重复使用两次。研究人员结合NADES特性，尝试合成对目标物选择性更高的新型固相吸附材料。Fu等[36]采用热水聚合法合成ChCl-Ph DES改性吸附剂作为SPE填料，相比传统C18色谱柱，它可以从棕榈样品中分离出更大量酚类化合物，并且经5次循环使用后仍表现良好的可逆性。Gao等[37]采用环保型深共熔溶剂和COF(共价有机框架)成功制备了高结晶度的COF-DES，基于COF-DES的SPE色谱柱在实际样品中对黄酮类化合物具有更好的吸附和选择性能。

此外，NADES可以作为酚类物质的配方载体，绕开溶剂的回收过程，直接应用于食品、化妆品及制药领域。例如Kyriakidou等[38]向壳聚糖基可食性薄膜中加入ChCl/Gly 石榴皮提取物，作为助剂改善膜的性能。NADES米糠提取物作为脂质抗氧化剂加入O/W纳米乳液中表现良好的抗氧化活性，iCALB生物转化提取物似可促进这种抗氧化效率。

4 总结与展望

天然低共熔溶剂具有低毒性、可调性、极性范围广、环保等特点，可作为不同基质中酚类物质绿色萃取溶剂，相比传统有机溶剂，天然低共熔溶剂组分可以与酚类物质形成氢键从而获得更高提取量，并且可保持酚类物质的稳定性。天然低共熔溶剂组分及摩尔比、加水量、温度等因素都会影响提取效率。天然低共熔溶剂对酚类物质的提取效率虽优于传统溶剂，但其具有黏度高、蒸气压低、成本高的缺点，另外，酚类物质与天然低共熔溶剂组分间存在的氢键网络使得提取后溶质的分离纯化过程存在一定困难。因此，酚类物质提取后的纯化和溶剂回收可作为未来研究的优选课题。

高黏度是限制天然低共熔溶剂作为萃取溶剂应用的主要缺点，可以通过提高温度或向体系中加水来降低其黏度，后续研究可探索更多天然产物组合设计低黏度天然低共熔溶剂。目前评价其提取效率的指标集中在总酚、总黄酮含量及抗氧化活性，从分子结构、作用机制等微观层面探究溶剂对某种酚类物质的选择性可作为进一步研究方向。此外，天然低共熔溶剂在提高酚类化合物的生物利用度方面也表现出优越性，其成分为天然代谢物，可作为目标物的载体直接应用于生产，而不需要进一步分离。关于天然低共熔溶剂安全性评价，目前多数研究采用体外细胞毒性测试的方法，天然低共熔溶剂对活性物质体内代谢的影响以及体内安全性需进一步阐明。随着未来研究的不断深入，天然低共熔溶剂有望成为新型绿色多功能溶剂，在天然活性产物提取及应用领域，实现多种用途。