凉粉草多糖提取、结构特征和生物活性研究

董 伟 马生健 郭俊先 罗 皓 陶美华

(1. 岭南师范学院生命科学与技术学院，广东 湛江 524048；2. 新疆农业大学机电工程学院，新疆 乌鲁木齐 830052)

凉粉草(MesonachinensisBenth.，MCB)又名仙草、仙人草、草馃、鲜草等[1]，系唇形科凉粉草属一年生草本宿根型植物[2]。凉粉草具有清暑解渴、解毒利尿的功效，民间常用作夏天清凉饮料，富含多糖、酚类、黄酮等活性成分[3-7]。

凉粉草多糖(Mesonachinensispolysaccharide，MCP)具有抗氧化、抗糖尿病、免疫调节等功效，还有良好的热稳性和促凝性，在食品和制药工业中常被用作增稠剂、稳定剂、凝胶剂[8-9]。目前，提取多糖的方法主要有水提法、碱提法、微波提取和酶提取法等，但操作时间长、成本高、投入大。碱提醇沉法具有提取时间短、成本低、易操作等优点，常被用来提取植物多糖。研究拟以新鲜凉粉草为材料，采用响应面优化碱提醇沉法提取多糖，并探究多糖的结构特征及生物活性，为凉粉草多糖的开发应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

凉粉草：匍匐型，经岭南师范学院陈燕教授鉴定，其种苗繁殖技术由广东省热带植物工程技术开发中心建立，种植于岭南师范学院科研试验基地；

铁氰化钾、碳酸氢钠：分析纯，天津科密欧试剂有限公司；

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、牛血清蛋白：分析纯，福州飞净生物科技有限公司；

考马斯亮蓝G-250、苯酚、三氯化铁：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

抗坏血酸(VC)：分析纯，西陇科学股份有限公司；

氯化钠、无水乙醇、浓硫酸、三氯乙酸等：分析纯，广州化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

电磁炉：GLMS9300A型，广州红三角电器实业有限公司；

电子分析天平：FA2204型，宁波市鄞州华丰电子仪器厂；

多功能商用豆浆机：FY-1055，中山市巴博莎电器有限公司；

高速冷冻离心机：SORVALL RC6 plus型，德国赫默公司；

电热恒温干燥箱：DHG-9037A型，上海跃进医疗器械厂；

同步热分析仪：STA 6000型，美国PerkinElmer公司；

紫外可见分光光度计：UV-8453型，美国Agilent公司；

傅里叶变换红外光谱仪：Nicolet 6700型，美国Thermo Fisher Scientific公司；

扫描电子显微镜：VEGA3 SBH型；荷兰PHILIPS公司；

X射线衍射仪：X’pert Pro MPD型，荷兰PANalytical公司。

1.3 试验方法

1.3.1 凉粉草多糖提取流程

新鲜凉粉草样品→洗净备用→热水碱提→离心→醇沉→离心→干燥→凉粉草粗多糖

1.3.2 多糖提取率测定 采用苯酚—硫酸法，并按式(1)计算多糖提取率。

R=(c×V)/m×100%，

(1)

式中：

c——凉粉草多糖溶液质量浓度，mg/mL；

V——多糖溶液体积，mL；

m——凉粉草样品的质量，mg。

1.3.3 凉粉草多糖提取单因素试验

(1) 碳酸氢钠添加量：称取新鲜凉粉草100 g，热浸时间10 min，料液比1∶5 (g/mL)，考察碳酸氢钠添加量(0.0%，0.4%，0.8%，1.2%，1.6%，2%，2.4%)对多糖提取率的影响。

(2) 热浸时间：称取新鲜凉粉草100 g，料液比1∶5 (g/mL)，碳酸氢钠添加量1.6%，考察热浸时间(0，5，10，15，20 min)对多糖提取率的影响。

(3) 料液比：称取新鲜凉粉草100 g，热浸时间10 min，碳酸氢钠添加量1.6%，考察料液比[1∶3，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7 (g/mL)]对多糖提取率的影响。

1.3.4 响应面试验 根据响应面中心复合设计原则，在单因素试验的基础上，采用Design-Expert 8.0.6软件进行数据分析。采用Box-Benhnken中心组合设计，进行三因素三水平试验，考察料液比、热浸时间和碳酸氢钠添加量对多糖提取的影响，优化提取工艺。

1.3.5 凉粉草多糖分离纯化 将最优条件获得的粗多糖溶液加入等体积三氯乙酸去除蛋白质，透析去除小分子杂质，蒸发浓缩，冷冻干燥备用。

1.3.6 指标测定

(1) 多糖含量：采用苯酚硫酸法[10]，回归方程y=0.009 9x-0.021 4，R2=0.991 9。

(2) 蛋白质含量：采用考马斯亮蓝法[11]，回归方程y=0.004x-0.006 7，R2=0.993 9。

(3) 糖醛酸含量：采用硫酸—咔唑法[12]，回归方程y=0.051 9x+0.003 2，R2=0.992 7。

1.3.7 热特性测定 称取6 mg干燥的凉粉草多糖，利用热重分析仪对多糖样品进行分析，扫描温度30～600 ℃，加热速率10 ℃/min。

1.3.8 光谱测定

(1) 紫外光谱测定：将多糖溶液配制成质量浓度为1 mg/mL，采用紫外—分光光度计于200～600 nm进行测定。

(2) 红外光谱测定：称取干燥后的多糖样品1～2 mg，与30～60 mg溴化钾于研钵中磨碎，压成透明薄片，测定范围400～4 000 cm-1。

1.3.9 X射线衍射 电压40 kV，电流40 mA，2θ范围下8°～35°内进行扫描，以观察多糖颗粒的晶型结构。

1.3.10 体外抗氧化活性测定

(1) DPPH自由基清除率:根据文献[13]并修改，配制0.2 mmoL DPPH，以VC为阳性对照。取DPPH溶液2 mL 和不同质量浓度(0.025～0.175 mg/mL)多糖样品2 mL 为样品组，避光放置30 min，测定517 nm处吸光度，并按式(2)计算DPPH自由基清除率。

(2)

式中：

A——自由基清除率，%；

Ai——样品组吸光值；

Aj——样品干扰试验的液吸光值；

A0——对照组吸光值。

(2) ABTS自由基清除率：根据文献[14]并修改，配制ABTS溶液，避光反应8 h，以VC为阳性对照。取2 mL 不同质量浓度(0.025～0.200 mg/mL)多糖样品，加入4 mL ABTS溶液摇匀放置10 min，测定734 nm处吸光度，并按式(2)计算ABTS自由基清除率。

(3) 还原力：根据文献[15]并修改，配制不同质量浓度(0.25～4.00 mg/mL)多糖溶液，以VC为阳性对照，取1 mL 样品，加入磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L，pH 6.6)和2.5 mL 0.1%铁氰化钾溶液，摇匀，50 ℃水浴20 min，迅速冷却，加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液、2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%三氯化铁溶液，测定700 nm处吸光值，并按式(3)计算还原力。

R=Ai-Aj，

(3)

式中：

R——还原力；

Ai——样品吸光值；

Aj——多糖溶液吸光值。

1.3.11 凉粉草多糖抑菌活性

(1) 菌种活化及菌悬液的制备：将菌种接种至酵母膏蛋白胨(LB)培养基，37 ℃培养12 h，转接1～2次。用细牙签挑取少量菌种，37 ℃、200 r/min培养12 h。测定600 nm处各菌悬液的OD值，以无菌水作对照。

(2) 抑菌圈直径(inhibitory zone diameter，DIZ)的测定：参照Sun等[16]的方法。

(3) 提取液对菌生长变化的影响：参考范明智等[17]的方法。

1.4 数据分析

采用Origin Pro 2018软件进行数据分析和作图，Design-Expert 8.0.6软件对数据进行分析和处理。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

MCP为可溶性酸性多糖，易溶于碱性溶液。由图1(a) 可知，当碳酸氢钠添加量为0.0%～1.6%时，多糖提取率随碳酸氢钠添加量的增大而迅速增长，当碳酸氢钠添加量为1.6%时达最大(7.52%)，随着碳酸氢钠添加量的加大，多糖提取率下降，是因为凉粉草多糖结构被破坏，且碱浓度过高会导致MCP在食品中应用时产生不良风味[18]，因此选取1.6%为碳酸氢钠的最适提取添加量。

由图1(b)可知，当热浸时间为0～10 min时，多糖得率随热浸时间的延长而增大，10 min时达最大值。继续延长热浸时间，多糖得率反而下降，是因为前期凉粉草细胞受热破碎，多糖溶出、得率增大，随着热浸时间的延长，高温破坏了多糖结构导致多糖被降解[19]。因此选取10 min 为最适热浸时间。

由图1(c)可知，当料液比为1∶3～1∶4 (g/mL)时多糖含量较低，此时溶剂较小，多糖未能充分溶解。当料液比为1∶5 (g/mL)时，凉粉草与溶剂反应充分，多糖含量最高。当料液比>1∶5 (g/mL)时，其他水溶性组分与多糖展开竞争，致使多糖溶出率下降。

图1 各因素对凉粉草多糖提取率的影响Figure 1 Effect of various factors on the exlraction yield of MCP

表1 响应面因素水平设计表

2.2 响应面法优化凉粉草多糖提取工艺

2.2.1 模型建立及显著性检验 采用Design-Expert 8.0.6软件对试验结果进行多元二次回归分析及方差分析，响应面试验因素水平见表1，响应面试验设计及结果见表2，方差分析见表3。多糖提取率的二次多项回归方程为：

Y=7.49+0.36A+0.31B+0.17C-0.13AB-0.23AC+0.10BC-1.06A2-1.22B2-0.17C2。

(4)

由F值可知，影响凉粉草多糖提取率的主次因素为A(碳酸氢钠添加量)>B(热浸时间)>C(料液比)。

2.2.2 各因素交互影响 由图2(a)和图2(b)可知，碳酸氢钠添加量方向曲面波动幅度较大，表明该因素对多糖提取率的影响较热浸时间影响显著。由图2(c)和图2(d)可知，料液比与热浸时间的交互作用对多糖提取率的影响呈马鞍状分布，当料液比一定时，随着热浸时间的增加多糖提取率先增加后小幅减小；当热浸时间不变时，随着料液比的增加，多糖提取率也先增加后小幅减小，但从等高线分布来看，BC的交互作用最弱。由图2(e)和图2(f)可知，多糖提取率随着碳酸氢钠添加量和料液比的增加先增加后减小，且在碳酸氢钠添加量方向影响较大，说明碳酸氢钠添加量是凉粉草多糖提取率的敏感影响因子。

2.2.3 提取工艺的验证 通过Design-Expert 8.0.6软件得出模型最优提取条件为碳酸氢钠添加量1.64%，热浸时间10.71 min，料液比1∶5.47 (g/mL)，预测凉粉草多糖最大提取率为(7.57±0.63)%。为检验结果的可靠性，进行3次平行实验，实测凉粉草多糖提取率为(7.73±0.17)%，与预测值接近，说明采用响应面法优化多糖提取工艺具有一定的可行性。

表2 响应面分析试验设计及结果

2.3 凉粉草多糖成分分析

经测定，凉粉草多糖总糖含量为109.51 μg/mL，蛋白质含量为85.521 μg/mL，糖醛酸含量为176.33 μg/mL。

2.4 热特性分析

由图3可知，MCP热分解的第一阶段主要集中在27～167 ℃，此阶段质量损失0.87 mg，是多糖中的游离水、结合水和受热易分解的化合物造成的。第二阶段集中在176～600 ℃，多糖在167 ℃处出现分解，该阶段的质量损失为2.87 mg，最终残留质量为1.26 mg,此阶段多糖因高温导致化学键被破坏而分解[20]。该结果与肖月欢[21]测得的两种MCP的试验结果一致。在所选温度范围内，MCP并未因高温被完全分解，其最终残留质量为1.26 mg，表明MCP具有较好的热稳定性。

表3 响应面方差分析表†

图2 各因素交互作用的响应面图和等高线图Figure 2 Response surface diagram and contour diagram of the interaction of various factors

2.5 光谱特性分析

2.5.1 紫外光谱分析 由图4可知，206～280 nm处有吸收峰，证明有多糖大分子存在，280 nm处出现最大吸收峰，说明得到的凉粉草多糖存在蛋白质、肽等化合物，可能为糖蛋白，与2.3测定的蛋白质结果吻合。

图3 多糖的残留质量变化曲线以及DTG曲线Figure 3 The residual mass change curves and DTG curves of MCP

图4 凉粉草多糖的紫外扫描图谱Figure 4 Ultraviolet scanning spectrum of MCP

2.5.2 傅里叶红外变换光谱分析 由图5可知，多糖红外光谱共性特征明显，3 401.80 cm-1处出现O—H伸缩振动吸收峰，2 037.10 cm-1处有一个较弱的C—H伸缩振动峰，通过这两个特征吸收峰，可判断受试物为糖类化合物[22]。1 619.93 cm-1处出现一个吸收峰，对应为羧基的非对称伸缩振动引起的吸收峰，表明多糖含有糖醛酸[23]。1 508.15 cm-1处吸收峰归属多糖苯环骨架的伸缩振动，1 095.90～1 018.00 cm-1处特征吸收峰为C—O和C—O—C的伸缩振动，为吡喃糖的特征吸收峰[18]。1 415.51，1 268.74 cm-1处吸收峰由醇类物质引起，为C—H的变角振动。887.00 cm-1处吸收峰说明其可能含有β-糖苷键，632.29 cm-1处吸收峰应为醇类含羟基和苯环变形角振动与变形振动[24]。综上，凉粉草多糖是一种具有β-糖苷键的吡喃糖型结构的酸性多糖。

2.6 X射线衍射

由图6可知，在2θ为8°～35°时，该衍射峰无明显吸收峰，表明凉粉草多糖以非晶形式存在，且X衍射曲线呈光束状[21]。

图6 多糖X射线衍射图Figure 6 X-ray diffraction spectra of MCP

2.7 SEM分析

由图7可知，凉粉草多糖表面疏松且有很多密集气孔，呈雪花状，层层叠起，还有很多细小颗粒附在片状物质表面，使多糖呈现较为蓬松质轻的形态。

图7 多糖的SEM图Figure 7 SEM image of MCP

2.8 抗氧化试验

由图8(a)可知，凉粉草多糖对DPPH自由基清除率随质量浓度的升高而升高，当多糖质量浓度为0.175 mg/mL时，其对DPPH自由基清除率达66.35%。林丽华[18]研究发现，1.6 mg/mL的凉粉草多糖对DPPH自由基清除率为55.59%；宋晓娟等[25]发现凉粉草多糖对DPPH自由基清除率的IC50值为19.13 μg/mL。综上，新鲜凉粉草多糖具有良好的DPPH自由基清除能力。

由图8(b)可知，随着质量浓度的升高，凉粉草多糖对ABTS自由基的清除率升高，当多糖质量浓度为0.175 mg/mL 时，其对ABTS自由基的清除率高达79.63%。曹媛媛等[26]研究发现，添加4%凉粉草提取物时，其对ABTS自由基清除率为67%；宋晓娟等[25]研究发现，凉粉草提取物在所选浓度范围内，对ABTS自由基清除率的IC50值为18.20 μg/mL。因此，新鲜凉粉草多糖具有良好的ABTS自由基清除能力。

由图8(c)可知，在0～4 mg/mL质量浓度范围内，随着多糖质量浓度的增加，吸光度变大，还原能力增大,当多糖质量浓度为4 mg/mL时,其吸光度可达1.431，高于林大成等[27]的结果，说明凉粉草多糖的还原能力接近VC，具有一定的还原能力。

图8 凉粉草多糖的体外抗氧化活性Figure 8 In vitro antioxidant results of MCP

2.9 抑菌活性

2.9.1 凉粉草多糖提取液抑菌活性及DIZ分析 抑菌圈直径可以反映菌种对多糖的敏感性，直径>20 mm为高度敏感，14～20 mm为中度敏感，<8 mm为不敏感[28]。由图9可知，1，2 g/mL提取物对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径分别为(8.93±0.01)，(10.24±0.02) mm，对大肠杆菌的抑菌圈直径为(7.84±0.02) mm，表明提取物对枯草芽孢杆菌的抑制作用最强。

图9 凉粉草多糖的抗菌图谱Figure 9 Antibacterial spectrum of MCP

2.9.2 凉粉草多糖对枯草芽孢杆菌生长的影响 由图10可知，以蒸馏水为对照，枯草芽孢杆菌的生长速率在选定范围内呈线性增加，而添加MCP后，枯草芽孢杆菌生长速率明显被抑制，与多糖对枯草芽孢杆菌敏感性试验结果一致，说明MCP具有一定的抑菌作用。

图10 凉粉草多糖对枯草芽孢杆菌生长的影响Figure 10 Effects of MCP on the growth of bacillus subtilis

3 结论

采用碱提醇沉法，结合响应面优化了新鲜凉粉草的提取工艺。结果表明，凉粉草多糖最优提取条件为碳酸氢钠添加量1.64%，热浸时间10.71 min，料液比1∶5.47 (g/mL)，此时凉粉草多糖提取率为(7.73±0.17)%。光谱分析结果显示，凉粉草多糖为酸性多糖，且具有β-糖苷键的吡喃糖型结构；X衍射图谱显示多糖曲线呈光束状，以非晶体形式存在；SEM结果显示，多糖表面形貌为浅蓬松状。体外抗氧化活性结果表明，多糖对DPPH自由基、ABTS自由基清除率分别高达66.35%，79.63%，具有较强的抗氧化活性。抑菌试验表明，凉粉草多糖能有效抑制枯草芽孢杆菌的生长，但抑菌机理还有待探究。