气相色谱质谱联用法测定白酒中4类风味物质

徐志飞 吴宇伉 蒋瑜宏 周 闰

(无锡市疾病预防控制中心，江苏 无锡 214023)

白酒复杂酒体体系中的某些微量成分不仅影响其风味、口感、品质，还有益于健康，探究白酒中微量成分对白酒品质和风味的影响是近年来白酒领域研究的热点[1-3]。

影响白酒风味的微量物质主要包括酯类、醇类、酸类、醛类、酮类、酚类、缩醛类等[4-6]。在白酒生产过程中，酸类通过酶催化与乙醇反应形成酯[7]。而酯化是一种可逆的化学反应，在白酒发酵后期以及贮存过程中，酯类又会分解成醇和酸，对白酒风味的形成起决定性作用[8]。醇类、酸类、醛类作为白酒风味的骨架成分，各类微量物质的不同造成不同香型白酒中风味物质的差异，研究白酒中各种风味物质对于提高白酒风味品质具有重要意义[9-11]。

现有白酒中风味物质分析检测的方法主要有气相色谱(GC)法[12-13]、气相色谱—质谱联用(GC-MS)法[14-15]、全二维气相色谱—飞行时间质谱(GC×GCTOFMS)[5]、气相色谱—嗅闻(GC-O)法[16]和电子鼻[17]等。GC法的灵敏度较低，特异性不高，只凭保留时间难以对复杂化合物中微量组分做出可靠的定性鉴定；GC×GC/TOFMS可对白酒中上百种成分进行定性分析，但普及度不高，暂且无法作为白酒分析的常规技术手段进行推广。GC-MS法灵敏度高、特异性强，应用范围较广，适用于常规的日常检测工作。目前白酒风味物质最常用的预处理方法有：直接进样(DI)、固相微萃取(SPME)、液液萃取(LLE)和固相萃取(SPE)、超临界流体萃取(SFE)[18-19]、同时蒸馏萃取(SDE)[20]等。LLE方法样品及萃取剂用量大、选择性差、对低沸点挥发性成分存在一定的损失；SPE方法所需萃取柱的成本较高、需要进行反复的试验优化、样品吸附量少、耗时长；传统的SPME具有萃取量不足和吸附竞争等缺点[13,21]。DI法操作简单、分析快速、可避免有机溶剂的污染和微量成分的损失，故研究拟建立直接进样联合GC-MS的方法测定白酒中风味物质，运用该方法测定市售3种不同香型白酒中的4类风味物质，探究不同香型白酒风味成分组成规律与差异，以期为白酒风味物质的进一步研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白酒(清香型、浓香型、酱香型各2份)：市售；

无水乙醇：纯度≥99.8%，上海安谱实验科技股份有限公司；

乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、丙醇、异丁醇、正丁醇、异戊醇：纯度≥99.0%，天津市康科德科技有限公司；

乙酸、丁酸、戊酸、己酸：纯度≥99.5%，德国Dr. Ehrenstorfer公司；

壬醛、癸醛：纯度≥99.1%，上海安谱实验科技股份有限公司；

AgilentFFAP、DB-1、DB-5、DB-624毛细管色谱柱(30 m×250 μm，0.25 μm)：安捷伦科技有限公司。

1.2 仪器与设备

气相色谱—质谱联用仪：Agilent 7890B-7000C型，美国安捷伦公司；

超纯水系统：Milli-Q Reference型，美国Millipore公司；

电子天平：XS105DU型，梅特勒托利多科技(中国)有限公司；

涡旋混匀器：IKA KS260型，德国IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液制备 称取14种风味物质各500 mg分别置于10 mL容量瓶中，加乙醇溶液(60%)定容，配制成质量浓度为50.0 g/L的标准物质储备液。分别移取一定量的单标储备液配制酯类质量浓度为5 g/L，酸类质量浓度为2.5 g/L，醇类和醛类质量浓度为0.5 g/L的混合标准溶液，再逐级稀释成标准曲线，使用前配制，混匀后上机测定。

1.3.2 样品处理 采集市场上不同香型不同品牌的6个白酒样品，移液器直接移取1 mL酒样于进样小瓶中，与标准曲线在相同色谱条件下直接进样检测，重复测定2次，以均值作为样品结果进行计算。另取60%乙醇溶液做基质，分别添加3种不同浓度的标准溶液进行加标回收试验的分析，每个加标水平重复6次。

1.3.3 色谱条件 进口样温度250 ℃，进样量1 μL，分流比20∶1；载气流量1.5 mL/min；FFAP色谱柱(30 m×250 μm，0.25 μm)；采用程序升温模式：80 ℃(1 min)→10 ℃/min→180 ℃(1 min)→ 30 ℃/min→240 ℃(1 min)。

1.3.4 质谱条件 电子轰击电离源(EI)，电离能量70 eV；离子源温度230 ℃；传输线温度250 ℃；选择离子扫描(SIM)，参数如表1所示；溶剂延迟1.5 min。

1.3.5 数据处理 采用安捷伦Mass Hunter workstation软件提取保留时间和色谱峰面积，每组试验重复测定回收率和相对标准偏差，用Microsoft Office Excel 2017软件进行数据处理。使用Origin 8.0绘图。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的选择

用同一份白酒样品分别使用不同极性的色谱柱(DB-1、DB-5、DB-624、FFAP)测试后发现，各待测物在非极性至中极性的柱子上虽能分离，但峰形较差，影响定量结果的准确性；而在FFAP柱上，各峰峰形尖锐，可获得满意的分离较果。故选用FFAP毛细管柱。14种目标物的定性离子、定量离子(见表1)色谱峰均获得良好分离，其中丁酸乙酯与正丙醇保留时间相近，但两种物质的定量离子不同，在定量计算中不受影响，标准色谱图(质量浓度为1.0 g/L的标准溶液)如图1所示。

表1 白酒中4类风味物质的SIM参数

1. 乙酸乙酯 2. 正丙醇 3. 丁酸乙酯 4. 异丁醇 5. 正丁醇 6. 异戊醇 7. 己酸乙酯 8. 乳酸乙酯 9. 壬醛 10. 乙酸 11. 癸醛 12. 丁酸 13. 戊酸 14. 己酸

2.2 分流比的选择

选择适当的分流比可改善峰形，特别是可显著改善醇类的峰形。试验设置分流比分别为1∶1，5∶1，10∶1，20∶1，30∶1，进样后发现随着分流比的增加，几种待测物色谱峰拖尾现象明显好转，但分流比较大时，检测器响应信号也变低(见图2)，综合考虑，选择分流比为20∶1。

图2 不同分流比下的色谱图Figure 2 Chromatograms under different split ratios

2.3 方法学考察

2.3.1 线性方程、检出限和定量限 根据实际样品中目标物的可能浓度范围，用乙醇溶液(60%)配制了不同浓度范围的混合标准溶液，其中酯类0.005～5.0 g/L，酸类0.002 5～2.5 g/L，醇类和醛类0.000 5～0.5 g/L，14种化合物线性良好，相关系数R2均大于0.998 5。将最低点混合标准溶液逐级稀释，取稀释后的溶液注入仪器，进样分析，选择3倍信噪比(S/N)对应的浓度即为检出限，10倍(S/N)对应的浓度即为定量限，根据结果可知，14种风味物质的检出限为0.007～0.07 mg/L，定量限为0.02～0.20 mg/L。线性方程、检出限和定量限详见表2。

表2 白酒中4类风味物质的线性范围、检出限和定量限

2.3.2 准确度与精密度 在白酒的风味构成中以酯类含量最多，酸类及醇类其次，根据样品的实际情况以60%乙醇溶液为基质进行低、中、高浓度水平的加标试验，酯类加标质量浓度为0.10，0.50，1.0 g/L；醇类及醛类加标质量浓度为0.01，0.05，0.1 g/L；酸类加标质量浓度为0.05，0.25，0.50 g/L，每个浓度水平重复检测6次。由表3可知，14种风味物质的加标回收率为87.8%～107.4%，相对标准偏差(RSDs)为2.0%～7.4%。GB/T 10345—2022《白酒分析方法》中规定在重复性条件测定下4种酯类的精密度不超过5%，乙酸和己酸不超过10%，研究结果符合国家标准的规定，说明试验测定结果准确，能满足酒样直接测定的需要。

表3 加标回收率和精密度

2.4 与已知方法比较

现有白酒中风味物质分析检测方法研究见表4。GC作为白酒中风味物质常用的定量技术，适用于白酒中常规化合物的测定，而对于风味物质中微量成分则无法准确定性，在胡瑾等[22]的研究中，虽然测定了白酒中多达57种风味物质，但未进行酸类物质定量检测。GC×GC/TOFMS可对白酒中上百种成分进行定性，但均未进行准确定量分析，且该类仪器的普及度远不如常规的色谱分析。

表4 与已知的白酒中微量物质测定方法的比较

2.5 实际样品检测

研究采集江苏无锡市场上3种最常见香型(酱香型、浓香型、清香型)6个不同品牌白酒样品进行检测，结果见表5。6个酒样中4类风味物质均可检测到，酯类相对含量在55.39%～75.41%，醇类相对含量在0.56%～9.23%，酸类相对含量在22.02%～37.67%，醛类相对含量在0.02%～0.07%。3种不同香型白酒中酯类、醇类和酸类物质占比较高，而醛类含量较低。酯类含量在不同香型白酒中差异较大，相较于浓香型和酱香型白酒，清香型酒样中酯类和酸类的总量最低，醇类和醛类无明显差异。

浓香型白酒中主要呈香物质为酯类和酸类，两类物质占总数的97%左右，其中己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸贡献最大，相对含量高达86%，己酸乙酯是其中占比最高的，其特殊的气味，赋予浓香型白酒香味，成为影响浓香型白酒风味的主要化合物。清香型白酒中酯类物质为主要的呈香成分，占比为67%左右，但低于浓香型白酒中酯类的相对含量74%，其中乙酸乙酯、己酸乙酯、乙酸贡献最大，相对含量高达70%左右，是清香型白酒的主要风味成分。2种酱香型白酒中酯类物质相对含量最高，但占比差异较大，其中样品5酯类物质为55%，样品6酯类含量为70%，因为“酱香”是由多种风味物质共同作用的结果，该结果与Liu等[20]的发现一致。白酒中的醇类不仅能呈香，而且能呈味，在6个酒样的醇类物质中，异戊醇含量最高。白酒中的酸类物质能起协调风味的作用，也是形成酯的前体物质，其中乙酸和己酸的含量相对较高，与李俊刚等[15]的研究结果一致。

3 结论

该研究利用气相色谱质谱技术分析了白酒中4类风味物质，建立了一个快速、稳定、灵敏的可有效分离4类风味物质并准确测定的方法。该方法分离效果好，可在15 min内完成白酒中4类风味物质的同时测定与定量分析，具有良好的线性关系，相关系数R2≥0.998 5，加标回收率在87.8%～107.4%，精密度在2.0%～7.4%，检出限为0.007～0.070 mg/L。酒样无需处理，直接进样，一定程度上消除了操作条件等的变化所引起的误差，测定结果干扰少，使白酒样品的测定更加简便，因此4类微量物质的实测结果即为最终报告结果。后期可尝试将不同预处理方法有机结合，进一步开展更多风味成分的检测分析。

表5 实际样品的检测结果