高尔基体磷蛋白 3及蛋白激酶D2在肺腺癌中的表达及其临床意义

臧志意，魏小东

肺癌的发病率位居世界第二而死亡率居世界首位，其病理类型多为肺腺癌，约占所有肺癌病例的40%[1-3]。尽管目前通过手术及新辅助治疗患者预后得到改善，但效果仍不理想，其高发病率及死亡率严重危害着患者的健康和生命[4]。肿瘤的发生发展与癌基因密切相关，因此通过分子水平探究肺癌发生发展的机制，可能为肺癌的治疗提供新的思路[5]。蛋白激酶D2(protein kinase D2,PKD2)是丝氨酸/苏氨酸激酶的蛋白激酶 D家族的成员之一，在反式高尔基体网发挥作用，其表达及活性影响着细胞的许多功能，包括蛋白的分泌、细胞的迁移、血管的生成及炎症的发生等[6]。高尔基体磷蛋白 3(Golgi phosphoprotein 3,GOLPH3)是一种癌蛋白,位于反式高尔基体网，参与了肿瘤细胞的生长、增殖与迁移，并与脑胶质瘤、结肠癌等不良预后相关[7]。目前国内关于肺腺癌中PKD2及GOLPH3的研究较少，本文通过分析PKD2及GOLPH3在肺腺癌中的表达情况以及与临床病理资料的关系，探究两者在肺腺癌发生发展中发挥的作用，为肺癌的诊治及改善患者不良预后提供新的思路。

1资料与方法

1.1 一般资料 收集2014-06至2018-06我院进行肺癌根治术、术后病理诊断为肺腺癌的106例患者的临床资料，其中男57例，女49例；年龄45～87岁，中位数66岁；Ⅰ期58例，Ⅱ期21例，Ⅲ期27例；出现淋巴结转移44例。本研究已通过我院伦理委员会批准(编号：2021-9-003)。

1.2 免疫组化染色 包埋蜡块连续切片厚度约为4 μm，采用SP法对106例肺腺癌病理组织切片及对应的40例癌旁组织进行染色，PKD2和GOLPH3工作浓度为 1∶100(抗体购自Proteintech公司)。阳性对照：按抗体说明书上组织切片阳性结果为阳性对照。阴性对照：按上述染色步骤进行，以PBS缓冲液代替一抗溶液为阴性对照。

1.3 显微镜结果判定 所有染色结果均由两名高年资病理科医师，采用半定量积分法判定：PKD2和GOLPH3蛋白主要表达于细胞质中。阳性细胞染色程度(括号中为评分)分为未染色(0)、淡黄色(1)、黄色(2)、深棕色(3)。阳性细胞所占比例(括号中为评分)划分为 0～5%(0)、5%～25%(1)、26%～50%(2)、51%～75%(3)、76%～100%(4) 。阳性细胞染色程度与染色比例评分相乘得到最终评分：0分(-)，1～3分(+)，4～5分(++)，>5 分( +++)。GOLPH3和PKD2的表达：-与+为低表达，++与+++为高表达；<4分为低表达，≥4分为高表达[8]。

1.4 随访 采用门诊定期随访及电话随访(截止日期2021-06-30)。

2结 果

2.1 肺癌组及对应癌旁组中GOLPH3与PKD2表达水平的比较 GOLPH3与PKD2表达于细胞质(图1)。40例肺腺癌组织中GOLPH3与PKD2的表达水平明显高于对应的癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05，表1)。

图1 肺癌组织与癌旁组织中相关蛋白表达情况(SP, ×200)

表1 肺癌组及癌旁组中 GOLPH3及PKD2表达的比较 (n；%)

2.2 GOLPH3与PKD2的表达水平与肺癌患者临床病理特征的关系 GOLPH3表达水平与年龄、性别、吸烟史、肿块位置、手术方式无关，与分化程度、肿块直径、淋巴转移、TNM分期有关(P<0.05)；PKD2的表达水平与年龄、性别、吸烟史、肿块位置、手术方式、分化程度无关，与肿块直径、淋巴转移、TNM分期有关(P<0.05，表2)。

表2 GOLPH3及PKD2表达水平与肺癌患者临床资料的关系 (n；%)

2.3 GOLPH3与PKD2在肺癌中表达水平的相关性 Cramer’V相关性分析提示GOLPH3与PKD2之间表达呈正相关性(V=0.363，P<0.05，表3)。

表3 GOLPH3与PKD2在肺癌组织中表达的相关性分析 (n；%)

2.4 影响肺腺癌患者预后的单因素分析 单因素分析结果显示GOLPH3及PKD2的表达水平、肿块直径、TNM分期、淋巴转移、组织分化程度会影响患者的生存时间(P<0.05)，而年龄、性别、吸烟史、肿块位置及手术的方式不影响患者预后(表4)。肺癌患者的中位总生存时间为49个月(4～83个月)，死亡51例，存活42例，失访13例。1、3、5年生存率分别为92.4%、61.6%、42.9%。高表达的GOLPH3与PKD2提示肺腺癌患者预后较差(表4，图2、3)。

图2 高尔基体磷蛋白3(GOLPH3)表达水平与肺癌患者预后关系

表4 影响肺癌患者预后生存的单因素分析

2.5 影响腺癌患者预后的多因素COX回归分析 将单因素分析中P<0.05的因素以及临床中有意义的因素纳入多因素COX回归分析中，结果显示，GOLPH3、PKD2高表达及TNM分期(Ⅲ期)是影响患者生存的独立危险因素(表5)。

图3 蛋白激酶D2(PKD2)表达水平与肺癌患者预后的关系

表5 影响肺癌患者预后生存的COX多因素分析

3讨 论

丝氨酸/苏氨酸激酶的蛋白激酶 D (PKD) 家族由PKD1、PKD2和 PKD3组成，属于Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaMK)超家族[6]。过往研究证据显示，PKD的表达及活性影响着细胞的许多功能，包括分泌、迁移、增殖及血管生成等[9]。同时，研究表明PKD表达及活性的失调与人类癌症的发生发展密切相关[10]。Pang等[11]通过下调肺腺癌细胞系中的PKD2表达，发现细胞周期在G2-M期停滞，提示PKD2的表达可能影响着细胞的生长及增殖。此外，Azoitei等[12]发现在肺癌、胰腺癌和乳腺癌细胞中，上调的PKD2会通过激活NF-κB抑制肿瘤细胞的凋亡，同时，PKD2还会诱导缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)激活血管内皮生长因子(VEGF)，导致肿瘤新生血管的生成，促进肿瘤的生长。而在本研究发现PKD2在肺腺癌组织中的高表达率明显高于癌旁组织，且PKD2表达水平与肿瘤的直径有关，直径≥3 cm的肿瘤PKD2高表达占比较直径<3 cm的更多，提示PKD2可能参与了肿瘤的增殖生长。Zhu等[13]在肝癌细胞中发现活化的PDK2会通过激活PI3K/Akt/GSK-3β途径诱导上皮间充质转化 (EMT)的发生，导致患者的预后较差。并且，有研究指出PKD2的上调会通过基质金属蛋白酶1/7/9(MMP-1/7/9)诱导癌细胞的侵袭及迁移[14, 15]。本研究发现，PDK高表达更易发生淋巴结转移及TNM分期更晚，提示PKD2可能参与了肿瘤细胞的迁移促进淋巴转移的发生与肿瘤的进展，造成高表达PKD2患者的预后较差。

最新研究显示，GOLPH3 是一种癌蛋白，其致癌活性主要与影响哺乳动物雷帕霉素靶标 (mTOR) 下游信号传导，导致哺乳动物 TORC1 和 TORC2 复合物的活化增强有关[16]。同时，GOLPH3参与了细胞生长、增殖、迁移，其表达的上调与脑肿瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌等多种肿瘤的不良预后相关[17]。GOLPH3位于反式高尔基体网，反式高尔基体网主要作用是参与识别不同的细胞产物，并将其分类到不同的运输囊泡群，运至质膜或其他目的地[18]。研究发现反式高尔基体富含大量 4-磷酸磷脂酰肌醇[PI(4)P]， GOLPH3是PI(4)P的效应物之一[19, 20]。过往证据显示，GOLPH3会通过与肌球蛋白18A(MYO18A)及F-肌动蛋白结合，将富含 PI(4)P的反式高尔基体膜连接到与顺行运输密切相关的肌动蛋白细胞骨架上[20, 21]。目前研究表明，PI(4)P /GOLPH3/MYO18A/F-肌动蛋白结构，为维持正常高尔基体囊泡运输和结构提供了所需的张力，并参与了大部分高尔基体到质膜的运输[22]。Ng等[23]发现PI(4)P /GOLPH3通路活性的适度增加会导致高尔基体延伸和顺行运输的轻度增加。Halberg等[24]进一步证明通过募集与激活GOLPH3 可以促进高尔基体延伸和增强囊泡释放，导致癌细胞细胞运动性增加、细胞外基质重塑、转移。此外，GOLPH3会促进多种高尔基体糖基转移酶的高尔基体内运输，过度表达易导致上皮间充质转化 (EMT)，改变细胞间黏附、侵袭与迁移的能力，导致肿瘤扩散[7]。而在本研究中发现，高表达GOLPH3的患者组织分化程度更低，肿瘤直径更大，淋巴结转移更多及TNM分期更晚，提示GOLPH3高表达可能参与了肿瘤细胞的生长与迁移，促进了肿瘤的进展。通过单因素及多因素分析得出，GOLPH3高表达的患者预后较差，并且其是影响肺癌患者预后的危险因素，这与文献[1]研究的结果一致。

现有研究显示，PKD2会从细胞质被募集到反式高尔基体网，参与囊泡形成和断裂以及协调细胞产物从反式高尔基体网到质膜的转运[25]。GOLPH3位于反式高尔基体网，其主要功能也是参与细胞产物从反式高尔基体网到质膜的运输，并且与高尔基体囊泡出芽密切相关[18]。研究发现活化的PKD2会通过激活PKD2/AKT通路，影响多种肿瘤细胞的增殖及迁移[13, 26]。而许多研究结果显示GOLPH3会通过GOLPH3/AKT/mTOR影响肿瘤细胞的增殖、侵袭及耐药性等[27-29]。PKD2及GOLPH3均位于反式高尔基体调节网络，并与囊泡的释放相关且都可激活AKT，提示两者可能存在某种联系。而Zhou等[30]研究发现脑胶质瘤中PKD2过表达提示患者预后不良，通过细胞系实验证实，PKD2的上调会通过PKD2/GOLPH3/AKT途径影响肿瘤细胞的增殖及迁移。在本研究中发现PKD2及GOLPH3在肺腺癌中的高表达率明显高于癌旁组织，并且两者呈正相关，说明两者可能存在某种机制联系， PKD2可能作为GOLPH3的上游通过PKD2/GOLPH3/AKT影响肺腺癌细胞的增殖，导致肿瘤的进展。因两者都与高尔基体囊泡功能相关，因此PKD2与GOLPH3两者可能通过影响高尔基体功能的改变，促进囊泡分泌造成癌细胞扩散，从而使得肿瘤进展。而由于目前本研究只是初步通过免疫组化分析探究两者关系，样本量较少且是单中心的研究，所以结果可能存在部分偏倚，因此未来有必要进行大样本及多中心的实验。

总之，PKD2与GOLPH3在肺腺癌中高表达，是影响肺腺癌患者预后的独立危险因素，并提示患者预后较差。因此，未来通过研制针对PKD2及GOLPH3作为治疗靶点的药物，阻断相关增殖迁移信号通路的激活，进而抑制肿瘤的进展，改善患者不良的预后，可能会成为肺癌治疗的潜在新方法。