抗氧化水凝胶材料在骨组织工程中的应用

王旭 吴楠 综述 裴锡波 审校

活性氧(reactive oxygen species，ROS)是人体代谢过程中的中间产物，对于骨稳态具有重要意义[1]。遗传、衰老、环境等因素导致的ROS的过度积累会导致炎症状态，进而导致牙周炎、骨关节炎等多种骨相关疾病[2]。利用抗氧化骨组织工程材料清除ROS已成为治疗上述疾病的重要策略之一[3]。其中，水凝胶是一种具有3D交联网络的新型功能高分子材料，具有与细胞外基质相似的多孔结构以及良好的生物相容性，可作为细胞或骨骼生长的载体材料。此外，其柔软的质地可以减少周围细胞和组织的炎症反应，与许多生物软组织相匹配。同时，可调的机械强度、形态可塑性和通用设计性也使其作为一种骨组织工程支架材料而备受瞩目。通过向水凝胶引入天然多酚、生物活性分子、无机化合物等抗氧化剂，使其获得抗氧化活性，已成为清除体内ROS的有效途径之一。本文总结了不同抗氧化水凝胶在骨组织工程领域的应用进展，并对抗氧化水凝胶的未来发展进行了展望。

1 活性氧

ROS包括一系列活性分子，例如过氧化氢(H2O2)、氢自由基(·OH)、氢氧根离子(OH-)、超氧阴离子(O2-)等。ROS主要来源于线粒体、内质网、过氧化物酶体和吞噬体，其中线粒体电子传递链产生了90%以上的ROS[4]。生理状态下，ROS被以超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、过氧化氢酶(CAT)为代表的体内抗氧化系统维持在正常水平，参与调控骨细胞的增殖、分化、成熟及矿化[5]。病理状态下，ROS因遗传、衰老、环境等因素异常增加，通过DNA和蛋白质损伤、脂质过氧化和酶促氧化来破坏组织，进而引发多种骨相关疾病，如牙周炎、绝经后骨质疏松症、骨关节炎、糖尿病性骨愈合延迟等，对患者机体功能和生活质量造成严重影响[6-8]。

2 抗氧化水凝胶在骨组织工程中的应用

2.1 天然多酚类

多酚是一大类植物来源的生物相容和可生物降解的化合物，是一种天然的抗氧化剂，广泛存在于蔬菜、水果、谷物、豆类中。多酚可分为5 个主要类别：类黄酮、单宁、酚酸、芪和香豆素[9]。研究表明多酚具有多种生物效应，包括抗氧化活性，其机理可能是通过羟基提供质子或电子来稳定自由基[10-11]。

2.1.1 类黄酮类 类黄酮类在天然多酚中占有很大比例，约有10 000 种天然类似物，其中姜黄素、儿茶酚、槲皮素等已被用于抗氧化水凝胶的构建中[12]。姜黄素是一种植物来源的类黄酮化合物，因其水溶性差、生物利用度低等原因，限制了进一步应用[13]。为解决上述问题，Li等[14]将姜黄素包埋在丝素蛋白水凝胶中，通过与丝素蛋白的疏水域结合，提高了姜黄素的稳定性。研究结果表明包裹在水凝胶中的姜黄素的抗氧化活性无论在干燥还是在水合状态下，均可保持至少1 个月，但该复合水凝胶被发现抑制了人骨髓来源的间充质干细胞(hBMSCs)的增殖。Chen等[15]则通过将姜黄素与Mg2+引入季铵化壳聚糖和苯甲醛封端的Pluronic®F127聚合物形成的水凝胶中，不仅提高了姜黄素的溶解度，同时这种复合水凝胶表现出良好的生物相容性、可注射性、自愈性和粘附性。研究结果还表明负载姜黄素的水凝胶不仅明显降低了炎症因子IL-1β和TNF-α的表达，同时上调了SOD1的表达，并显著减少BMSCs的凋亡，为肌腱-骨愈合提供保护性微环境。

儿茶酚是一种绿茶中提取的多酚化合物，已作为一种天然抗氧化剂应用于各个领域[16]。Chen等[17]为了赋予临床常用钛基材抗氧化活性，利用逐层自组装技术(LBL)在钛基材表面构建了由壳聚糖-儿茶酚、明胶和羟基磷灰石纳米纤维组成的多层结构。结果显示，在钛表面形成的多层结构不仅具有良好的软组织粘附性，而且可以通过调节细胞粘附相关基因、抗凋亡和促凋亡相关蛋白的产生来有效保护成骨细胞免受ROS损伤。体内研究证明多层结构大大提高了钛种植体在骨/种植体界面处的骨与种植体结合强度和骨体积。Liu等[18]则将类沸石咪唑酯骨架-8纳米颗粒(ZIF-8 NP)引入儿茶酚-壳聚糖多功能水凝胶，以达到促进成骨分化，并加速骨重建的目的。该水凝胶在临床应用中表现出优良的流变性能、可靠的机械强度和出色的附着力。多功能水凝胶增强了大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)中血管内皮生长因子的旁分泌，保证骨缺损区的血供重建。此外，水凝胶释放的ZIF-8 NPs还可以上调碱性磷酸酶、胶原蛋白1和骨钙素的产生和分泌，促进rBMSCs的成骨分化。在颅骨缺损模型中，显微CT和组织学分析表明，水凝胶导致更多的矿化和新生血管形成，并提高了骨再生的质量和速度。

槲皮素也是一类天然黄酮类化合物，存在于各种水果和茶叶中。在一项研究中，槲皮素被掺入一种基于壳聚糖的热敏水凝胶中以增强生物活性环境，从而促进细胞增殖和成骨分化，并减少自由基分子引起的细胞损伤[19]。该热敏水凝胶可以在体温条件下从溶液转变为凝胶，使其能很好地填充不规则形状的骨缺损，并减少手术暴露。

2.1.2 单宁类 单宁，是一种水溶性天然多酚化合物，常见于坚果等植物中，已被FDA批准用作直接食品添加剂[20]。单宁分为可水解单宁和缩合单宁。水解单宁来源于没食子酸与葡萄糖的酯化反应及其氧化反应产物，其中没食子酸是最基本的成分[21]。一项研究将没食子酸加入由壳聚糖、β-甘油磷酸钠和碱性磷酸酶组成的用于骨再生的可注射水凝胶，以增加抗氧化活性[22]。添加的没食子酸在体外实验中表明对MG63细胞的粘附和生长没有负面影响，但细胞的矿化降低了水凝胶的抗氧化活性。此外，该水凝胶还表现出显著增强的抗菌活性。另一项研究则报告了一种基于单宁酸(TA)的纳米凝胶作为有效的ROS清除剂[23]。研究者通过将聚合苯硼酸酯和TA简单混合以在其之间形成苯硼酸酯键来制备该纳米凝胶。ROS清除试验揭示了凝胶的显著抗氧化作用。此外，凝胶还显示出高生物相容性和强抗炎作用。

缩合单宁由多羟基-黄烷-3-醇低聚物通过黄烷醇单元之间的C-C键组成，比植物中的可水解单宁更常见，结构更复杂。原花青素是一类比较常见的缩合单宁。据报道，原花青素可以刺激骨形成并调节破骨细胞的骨吸收，因此非常适合治疗包括骨质疏松症在内的溶骨性疾病[24]。凭借这种有益的生物学效应，原花青素成为了钛植入物功能化的理想候选者，可清除ROS和增强骨整合。Tang等[25]利用LBL将原花青素封装在由带正电荷的壳聚糖和带负电荷的透明质酸组成的多层网络的微间隙中，从而实现其持续和受控的释放。药物释放测定显示原花青素可在14 d内受控和持续释放。在体外H2O2诱导的氧化应激条件下，原花青素增强了MC3T3-E1细胞成骨潜力。体内实验中，种植体周围骨矿物质密度(BMD)、骨体积分数(BV/TV)和相关小梁骨参数的定量形态分析也证实了原花青素修饰的钛植入物的新骨形成增加。

2.1.3 其他 白藜芦醇是一类天然芪类多酚，但受到其水不溶性和体内快速代谢的阻碍，无法作为一种有效的抗氧化剂。为解决上述问题，Wang等[26]将白藜芦醇被接枝到聚丙烯酸上，以获得一种大分子药物，然后将其掺入去端胶原水凝胶中以制备骨组织工程支架。支架展示了BMSCs免受ROS侵害的能力，同时发现骨缺损区域的炎症相关基因下调，而骨和软骨相关基因上调。

木质素是一种含有酚羟基的多酚复合物，具有抗氧化、抗菌特性，在自然界中储量丰富。Abudula等[27]将木质素与明胶相结合，开发了一种多功能，即抗菌、抗氧化和可注射的冷冻凝胶。木质素的引入不仅赋予了凝胶抗氧化、抗菌功能，同时显著改善了凝胶的机械性能。此外，研究还发现含有0.2%木质素的冷冻凝胶可最小程度地激活小鼠骨髓来源的树突状细胞。另一项研究则开发了一种含有木质素的3D打印水凝胶支架[28]。Micro-CT评估表明，与未处理的缺损相比，植入支架的缺损部位形成了更多的骨组织，提示有利于骨组织再生。

2.2 生物活性分子

除了天然多酚这一类抗氧化外，生物活性分子如氨基酸、肽、细胞因子、多糖等也被用于抗氧化水凝胶的构建。N-乙酰半胱氨酸(NAC)是内源性抗氧化剂谷胱甘肽的前体物质，具有直接的抗氧化作用。在一项研究中，由半胱氨酸修饰的γ-聚谷氨酸(PGA-Cys)组成的有机水凝胶被用作支架材料，并在其中添加HA和MgO纳米颗粒，以用于糖尿病骨缺损重建。复合水凝胶可以有效促进BMSCs的迁移和增殖，还可以诱导成骨分化以及减少M1型巨噬细胞浸润。此外，在将HA/MgO-H支架植入糖尿病大鼠股骨缺损区后的第8周，显微CT成像显示了更有效的骨修复[29]。另一方面，同时将NAC和谷胱甘肽封装到甲基丙烯酰明胶中也被证实是保护细胞免受氧化应激损伤的有效策略之一[30]。

用于抗氧化水凝胶的细胞因子一般不直接发挥抗氧化作用，而是通过调节巨噬细胞极化，从而间接减少ROS的产生。在糖尿病条件下，高血糖一方面会导致促炎性M1巨噬细胞能量代谢旁路的异常激活，从而增加ROS的产生。另一方面，葡萄糖波动等信号可以延长M1巨噬细胞的局部滞留时间，同时显著延迟M2巨噬细胞表达。基于上述原理，Li等[31]设计了一种由苯基硼酸交联聚乙烯醇和明胶胶体组成的双网络水凝胶，它可以根据动态糖尿病微环境确定何时开始释放所载药物。负载IL-10和BMP-2的上述水凝胶可以在急性炎症的早期释放IL-10用于免疫调节，而BMP-2可以稍后释放以匹配成骨细胞的激活。此外，IL-10被发现可以重塑线粒体相关的抗氧化系统来调节巨噬细胞极化，从而增强糖尿病骨缺损的成骨作用。

多糖也被报道可发挥抗氧化作用。一种通过氧化支链淀粉和八臂乙二醇(PEG)肼共价交联开发出的可注射聚合物水凝胶，在1 h内抑制了68%的自由基；同时水凝胶释放的地塞米松抑制了MC3T3-E1中的促炎标志物IL-6和IL-1β，并提高了抗炎标志物TGF-β[32]。另一种添加了黄蓍胶多糖的水凝胶也表现出优异的抗氧化活性，可减少产生50%的ROS，并使成骨分化标志物的表达高出1.5～2.5倍[33]。总体而言，尽管多糖抗氧化剂的应用较少，但其表现出较好的抗氧化活性和成骨活性，可用于氧化应激条件下的骨修复应用。

2.3 无机化合物

用于ROS清除水凝胶的无机化合物可分两类：一类是无机纳米粒子，另一类则是无机官能团。前者包括二氧化铈(CeO2)、富勒醇等，后者则包括硼酸、硫等。二氧化铈纳米粒子已知可清除超氧阴离子、过氧化氢和羟基自由基，其催化抗氧化特性归因于每个氧化态之间的循环氧化还原反应。Varini等[34]研究了基于藻酸盐水凝胶和中孔玻璃的珠子中铈含量对珠的生物活性和生物相容性的影响。随着Ce含量的增加，珠子显著改善了前成骨细胞MC3T3-C1细胞的增殖，然而细胞分化随之减少。结果表明具有1.2%和3.6%的CeO2的珠子是兼具抗氧化活性和生物活性的最佳支架候选者。富勒醇是富勒烯的衍生物之一，具有抗氧化作用，但其具体机制未明。Yang等[35]使用微流体技术将富勒醇纳米晶体掺入水凝胶微球中，以原位构建富勒醇-水凝胶微流体球(FMS)调节干细胞的氧化还原稳态并促进难治性骨愈合。研究表明，FMS表现出优异的抗氧化活性，可抑制细胞内和细胞外ROS，使干细胞免受氧化应激损伤。此外，还可以通过激活FoxO1信号有效地促进干细胞的成骨分化。

由于对ROS的高灵敏性，硼酸、硫缩酮等常被用于ROS响应材料的响应元件，不仅可用来清除ROS，同时可以实现负载药物在ROS富集部位的精准释放，提高治疗效果。最近，硼酸被用于构建一种可注射水凝胶，强力霉素和二甲双胍则通过B-N配位结合到水凝胶中，该系统可以提高载药效率，并实现ROS触发的局部药物释放[36]。该水凝胶对牙龈组织具有适当的粘附性，生物相容性好，并对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和牙龈卟啉单胞菌具有显著的抗菌作用。此外，双载药水凝胶在糖尿病大鼠牙周炎模型中使得牙槽骨丢失明显减少，组织学评估也进一步表明其通过减少炎症细胞浸润和发挥抗破骨细胞作用，从而在治疗糖尿病牙周炎中发挥积极作用。硫缩酮具有许多用于合成大型组织工程材料的理想属性，其可通过低成本、低毒性前体的简单缩聚来合成，形成对水解惰性但可被ROS特异性降解的聚合物链。Martin等[37]报告了一种硫缩酮聚合物交联的基于PEG的水凝胶，并将其用作细胞可降解、抗氧化的干细胞递送平台。实验中观察到该水凝胶包裹的MSC在11 d内明显保持更高的活力，并比与酶促降解肽交联的金标准水凝胶多维持了40%以上的活细胞，提示可作为细胞递送的支架材料。

3 小 结

ROS的过量产生是导致包括牙周炎、骨关节炎、糖尿病骨缺损在内的骨相关的慢性炎症性疾病的显著病理因素，而以水凝胶为代表的抗氧化生物材料已被提出做为治疗上述疾病的有效策略之一。许多来源可作为抗氧化剂引入水凝胶中，包括天然多酚、生物活性分子、无机化合物，制得的抗氧化水凝胶表现出了令人满意的抗氧化活性，同时显著改善了抗氧化剂原有的限制如水溶性差，生物利用度差等，保护细胞免受氧化应激损伤，增强了其生物活性和成骨能力。此外，一些抗氧化水凝胶设计时综合考虑了ROS清除机制、持续时间以及疾病的具体情况，对特定疾病起到了较好的治疗效果。

尽管近年来抗氧化水凝胶在骨组织工程中的应用取得了一定的进展，许多研究在水凝胶的制备、改性、应用等方面进行了富有成效的探索，但目前制备的抗氧化水凝胶仍存在一些问题亟待解决，如降解速率与骨再生速率不能精确匹配，机械性能未能满足临床需求，促进骨再生能力不足等，因此制备可控降解速率、优良机械性能、显著促进成骨的抗氧化水凝胶是该领域重要的研发方向之一。为了获得良好的骨修复效果，抗氧化水凝胶应随着时间的推移而降解，逐渐被宿主骨组织取代，因此降解速率应与骨生长速率相似。另外大多数水凝胶植入物的一个缺点是它们是软材料，为了改善其机械性能，已进行了引入纳米材料、引入官能团、改变聚合条件等多种有益的尝试[38]。此外，抗氧化水凝胶应具有良好的成骨能力，可通过负载生长因子、细胞因子和细胞以促进损伤部位的修复，但应思考抗氧化组分与所负载细胞及细胞因子之间的相互作用。目前研究虽然面临着上述问题和挑战，但相信在不久的将来，随着研究的深入，抗氧化水凝胶将在未来具有广阔的应用前景。