铁离子对视网膜光损伤的毒性作用研究进展

傅晓颖，邓晓敏，彭佳媛，余小平

光感受器高度依赖含铁酶。胞内产生过量亚铁离子时，亚铁离子通过芬顿反应产生活性氧分子（reactive oxygen species，ROS）[1]，引起细胞氧化还原水平失衡进而发生膜脂质过氧化反应，诱导视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial，RPE）细胞和光感受器细胞凋亡[2]。近年研究[3-4]已证实，铁螯合剂具有抗氧化活性，对视网膜色素变性、视网膜动脉阻塞、青光眼等视网膜疾病皆有一定治疗作用。本文就铁离子对视网膜光损伤的毒性作用及铁螯合剂治疗研究进展进行综述。

1 视网膜铁代谢途径

1.1 视网膜铁的摄取储存与利用

血液循环中大多数非血红素铁可先与转铁蛋白（transferrin，Tf）结合，再与RPE 细胞基底外表面和视网膜血管内皮细胞（retinal vascular endothelial cells，rVECs）顶端的转铁蛋白受体（transferrin receptor，Tfr）结合，将铁释放入细胞内[5]。细胞内铁与Tf 和Tfr解离后进入一个可以被利用、储存或输出的不稳定铁池（labile iron pool，LIP）。LIP 中过量的铁储存于铁蛋白（ferritin，Ft）内，Ft 是一种由重链（21 kDa）和轻链（19 kDa）组成的多亚基蛋白。铁蛋白重链（ferritin heavy chain，FtH）具有铁氧化酶活性，能够将过量亚铁离子转化为铁离子，促进铁离子在铁蛋白轻链（ferritin light chain，FtL）里积累，增加细胞抗氧化功能[6]。膜铁转运蛋白（ferroportin，Fpn）是胞内唯一的排铁蛋白。其可在铜蓝蛋白（ceruloplasmin，Cp）和铁转运辅助蛋白（hephaestin，Heph）的协助下，将亚铁离子氧化为铁离子，令铁更容易转运至细胞外。而rVECs 中Fpn 可通过血视网膜屏障将铁输入视网膜，视网膜内铁转运到光感受器外节，RPE 细胞吞噬光感受器外段，释放铁离子到视网膜外毛细血管，最终铁从光感受器循环到血液[7]。Fpn 受铁调素（hepcidin，Hepc）调控，Hepc 与Fpn 胞外结构结合，引起Fpn 降解限制胞内铁输出。铁调节蛋白（iron regulatory proteins，IRP）是维持机体铁稳态的关键调控蛋白。细胞内铁含量低时，IRP 与铁反应元件结合，阻碍Ft 和Fpn mRNA 有效翻译，保护Tfr mRNA 稳定性，增加细胞内可利用的铁。当铁含量充足时，铁可以与IRP 结合引起构象改变，促进Ft 和Fpn 转录翻译，破坏Tfr 和二价金属离子转运体（divalent metal-ion transporter-1，DMT1）mRNA 稳定性，细胞吸收铁减少储存铁增多[8]。

1.2 视网膜铁的调节

视网膜细胞内铁含量由多种调控因子控制。Tfr 在铁的摄取过程中起关键作用，Tfr1 和Tfr2 是Tfr 的2 种亚型。由于Tfr1 与Tf 亲和力高，铁主要通过Tfr1 介导的机制进入细胞[9]。细胞缺铁时Tfr1 表达增加，铁过量时Tfr1 表达减少。Ft 是一种能够抵抗细胞凋亡，促进细胞生存的蛋白。不仅用于储存铁离子，还能增加p53 转录活性，保护细胞不受氧化应激损伤[10]。Picard 等[11]发现，1 个FtH 等位基因的丢失会有利于光诱导视网膜变性。他们对野生型H 铁蛋白（wild-type H ferritin，HFt+/+）小鼠和杂合型H 铁蛋白（heterozygous H ferritin，HFt+/-）小鼠进行同样的光照处理后，发现HFt+/-小鼠视网膜变性范围比HFt+/+小鼠更广。血清Ft 含量与铁储备水平呈正比，监测血清Ft 浓度可用于判断是否存在铁超载或铁缺乏的现象[12]。

除肝脏以外，其他器官如大脑、心脏、肾脏和视网膜Müller 细胞、RPE 细胞等也会产生Hepc[13-14]。Baumann 等[15]对肝脏特异性Hepc 基因敲除（liver-specific hepc knockout mouse strain，LS-HepcKO）小鼠和视网膜特异性Hepc 基因敲除（retinaspecific hepc knockout，RS-HepcKO）小鼠进行研究。结果显示，LS-HepcKO 小鼠血清铁含量升高，同时出现视网膜铁超载和视网膜退化的现象。而RS-HepcKO 小鼠视网膜铁含量没有变化，视网膜也不发生变性。这表明肝脏特异性Hepc 缺失会造成血清铁含量升高，导致视网膜内铁积累和视网膜退行性变。而视网膜虽然也分泌特异性Hepc，但并不影响血清铁浓度。

2 铁毒性与视网膜光损伤

2.1 铁毒性的机制

血液中Tf 含量有限，当Tf 达到约70%饱和时会出现游离铁，这种铁被称为非转铁蛋白结合铁（non-transferrin bound iron，NTBI）。NTBI 是一种具有氧化还原活性的、潜在的铁毒性形式，主要通过DMT1、锌铁转运蛋白14 或L 型和T 型Ca通道进入细胞[16]。NTBI 是Fe3+与小分子如柠檬酸盐、乙酸盐和磷酸结合的混合物。柠檬酸盐和抗坏血酸盐在Tf 周期内有协同作用，促进铁从Tf-Tfr1 释放[17]。细胞中游离的不稳定铁或循环中NTBI 可以通过芬顿反应催化羟基自由基形成[18]。羟基自由基可引起脂质过氧化、DNA 链断裂和生物分子降解，导致分子和细胞功能障碍。

2.2 视网膜光损伤

虽然光是形成视力和调节昼夜节律的基本要素，然而过多光线集聚在视网膜上会造成光热损伤、机械损伤和化学损伤[19]。光能从光传递到视网膜组织会产生光热损伤。光能等于普朗克常数乘以光速除以光波长。固定的光照时间下，波长越短，能量越大，温度上升速度越快。热能增加细胞会产生不同程度的损伤，包括蛋白质变性、分子三级结构丧失。视网膜光热损伤常见于临床使用激光治疗各种视网膜疾病，如糖尿病性视网膜病、视网膜水肿、视网膜肿瘤和视网膜脱离等[20]。光机械损伤是指由于将能量快速输入RPE 细胞的黑素体而产生机械压缩或拉伸，这些压缩力和张力会产生冲击波，对RPE 细胞或感光细胞造成永久性损伤。光诱导视网膜损伤以光化学损伤为主，眼睛中的发色团吸收紫外线或可见光，导致能量、质子或电子转移到其他分子，进而发生化学反应产生自由基或活性氧，诱导脂质过氧化，破坏细胞膜结构[21]。光化学损伤的受到多因素的影响，如暴露时间、强度、体温、昼夜节律和环境条件等。视网膜的光化学损伤分为两类，第一类损伤由光感受器细胞中视紫红质激活介导，其特征是白光辐照度较低，曝光时间可持续数日或数周，第二类损伤是在高辐射白光下产生的损伤，其主要发生在RPE 细胞和感光细胞[22]。

铁是光转导酶的辅助因子，感光细胞和RPE 细胞含铁量较高。白光照射感光细胞12 h 后可发现亚铁离子含量显著增加，羟基自由基产生增多，感光细胞死亡增加[23]。因此，视网膜光化学损伤可诱导铁离子过量。RPE 细胞氧化应激损伤是光诱导视网膜损伤过程中一重要特征。光反应性维生素A 醛类化合物在RPE 细胞中老化积累，其中N-亚视黄基-N-视黄基-乙醇具有类双视黄醇结构是RPE 细胞脂褐素的主要荧光基团[24]。这些化合物在光照下能降解成含醛和二羰基碎片，可介导分子和细胞损伤。Ueda 等[5]发现，铁出口蛋白Heph 和Cp缺乏时，小鼠RPE 细胞内铁含量增加而类双视黄醇浓度降低。铁能与类双视黄醇和脂褐素相互作用加重细胞损伤程度，诱导视网膜变性。相反，黑色素可以结合大量铁来保护RPE 细胞免受铁诱导的氧化应激作用，而蓝光照射会降解黑色素小体从而导致其抗氧化能力丧失[25]。

2.3 年龄相关性黄斑变性

年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）是一种退化性视网膜疾病，可导致60 岁以上人群失明。持续光照会加重AMD 的发展进展，其特征是中央视网膜中感光细胞变性和视网膜上皮层受损。因此，光诱导的光感受器细胞死亡模型可广泛用于阐明AMD 和视网膜变性的损伤机制[22]。AMD 的发病机制与氧化应激、脂质积聚、炎症、补体通路的失调和异常血管生成有关[26]。其中，铁浓度增加诱导的氧化应激可能是导致AMD 的重要原因[27]。研究[28]发现，相对于健康人群，早期AMD 患者的RPE 细胞和Bruch 膜中铁含量增加并继发性引起光感受器退化。同时，干性AMD 患者出现感光细胞和RPE 细胞退行性改变、脂褐素的堆积，房水中发现铁浓度增加，从另一方面证实了铁在AMD 发病机制中的作用[29]。AMD 中铁蓄积的原因与铁的运输和储存异常有关，Tfr1、Tfr2、IRP1、IRP2 基因的多态性与AMD 的发展有关[30]。收集AMD 患者的血液样本，可观察到Tf 和Tfr1 浓度显著增加，而Ft 浓度显著降低。新生血管性AMD 中存在网膜下出血，引起进行性光感受器退化[31]。铁对视网膜的毒性作用、光感受器与RPE 细胞的分离和纤维血管膜的增殖都能造成视网膜下出血。

3 铁毒性与遗传性视网膜疾病

3.1 无铜蓝蛋白血症

无铜蓝蛋白血症是一种罕见的由Cp 基因变异引起的常染色体隐性疾病。Cp 可将亚铁离子转化为铁离子来促进铁的输出。无铜蓝蛋白血症患者的脑、视网膜和胰腺都会因铁输出障碍进而出现铁过载现象，其临床表现包括视网膜变性、糖尿病和痴呆等。组织病理学检查显示患者视网膜可见玻璃疣、RPE 细胞铁堆积、细胞肥大、黑色素异常等。在Cp 和Heph 敲除的小鼠中，也可观察到视网膜铁含量增加，且出现具有AMD 特征的视网膜变性，例如年龄依赖性RPE 细胞肥大、光感受器变性和视网膜下新生血管生成。

3.2 遗传性血色素沉着症

遗传性血色素沉着症是一种由人类遗传性血色素沉着症基因（hereditary hemochromatosis gene，HFE）突变引起的铁摄入增强的疾病。HFE 蛋白通常能够与Tfr 结合并形成稳定的复合物，降低Tfr 与Tf 的亲和力，减少铁离子转运。HFE 主要在RPE 细胞中表达，HFE 突变将影响复合物的形成，使铁吸收增加，最终导致视网膜铁过载和视网膜变性。此外Fpn、Hepc 和Tfr2 基因变异也可以导致血色素沉着病[32]。

因此，视网膜铁的摄取、贮存、输出等任一环节出错都可引起铁代谢障碍，产生毒性作用，引起视网膜细胞氧化损伤。总之，铁是感光细胞和RPE 细胞中氧化损伤及细胞死亡的重要因素。

4 铁螯合剂对视网膜的保护作用

铁螯合剂可以结合铁离子形成稳定的复合物，降低其毒性作用，保护视网膜免受铁诱导的氧化损伤。去铁胺（deferoxamine，DFO）、去铁酮（deferiprone，DFP）和地拉罗斯是3 种广泛使用的铁螯合剂。在视网膜色素变性和光诱导视网膜损伤模型中，DFO 可减少RPE 细胞和Bruch 膜中过多铁离子并保护视网膜结构功能。但DFO 为一种亲水性铁螯合剂，必须以肌肉注射或静脉注射的方式给药。同时DFO 会造成视网膜神经毒性，例如视野缺陷、视力下降、色觉缺陷及视网膜电图波幅下降等[33]。相比之下DFP 可以口服，且与铁的亲和力较低，对小鼠视网膜没有毒性作用。给Cp 和Heph 敲除小鼠喂养含DFP 的饮用水可降低视网膜铁含量和氧化应激水平。在光诱导的视网膜变性中，DFP 可减少光诱导的小胶质细胞侵袭，提高光感受器存活率。

Tf 作为铁主要转运体，也是一种天然的铁螯合剂。其主要特性是控制体内铁含量，避免任何游离不稳定的铁产生。此外Tf 还能调控铁代谢相关蛋白的表达，降低铁介导的氧化损伤。研究[34]表明，在小鼠进行光照前向玻璃体内注射Tf 可以下调Tfr1、Fpn、Ft 和DMT1 mRNA 表达，防止持续光照引起早期铁代谢失衡，保护感光细胞核层形态。在光诱导视网膜变性后向玻璃体注射Tf，可增强Tfr2-Fe-Hepc 通路减少血清铁浓度。因此，Tf 既可以预防视网膜中铁的积累，还可以延缓视网膜退化。Daruich 等[35]指出，在视网膜脱落模型中，Tf 除了能恢复铁的稳态、减少视网膜脱落引起的细胞凋亡和细胞坏死，还能激活神经保护通路如IGFBP3 通路并介导神经保护作用。另外，植物中的天然分子，如姜黄素、多酚和黄酮类化合物，也能够与铁等金属离子结合形成稳定的络合物，进而减少ROS 的产生[36]。

4 小结

视网膜从铁的摄取、运输、储存、利用等方面，调节铁代谢相关蛋白的表达，维持铁代谢平衡。铁过载可能是光诱导视网膜变性的主要原因之一。铁螯合剂可成为预防视网膜变性的潜在治疗靶点。虽然研究表明过量铁可引起视网膜细胞损伤，但其具体机制的研究还不明确。除已知的铁过载发生机制以外，还有哪些因素可引起铁代谢紊乱、铁过载能否通过其他方式诱导细胞死亡、铁螯合剂在光诱导视网膜疾病中的作用机制等问题都还需要进一步探讨。相信对铁过载的深入研究，将有助于研究者进一步明确视网膜内铁代谢的具体机制，为研究和治疗视网膜光损伤提供更多的理论依据。