雌激素调节自噬的细胞保护作用研究进展

孙琦，张红综述 赵自刚审校

雌激素包括雌酮、17β-雌二醇(17β estradiol，E2)、雌三醇，通过雌激素受体(estradiol receptors，ERs)发挥作用，参与诸多生理功能的调节，如细胞的生长、分化、代谢和死亡等。生理条件下，细胞自噬是细胞代谢过程中的衰老细胞器和异常蛋白质等成分降解的过程，受多条信号通路与多种信号分子的调节，有利于维持细胞稳态；病理状态下，自噬被激活或抑制，参与多种疾病的发生发展，调节细胞自噬对于防治相关疾病具有积极作用[1]。研究表明，雌激素通过其受体ERα、ERβ和G蛋白偶联雌激素受体(G-protein coupled estrogen receptor，GPER)对自噬发挥双向调节作用，从而在疾病防治中发挥有益作用[2]。本文综述雌激素对细胞自噬的双向调节作用与部分机制，以期加深对雌激素药理作用的认识，为相关疾病的防治提供新思路。

1 细胞自噬概述

细胞自噬为一个高度保守的细胞分解代谢过程，是内环境稳定的主要贡献者，在细胞分化和发育、蛋白质和细胞器质量控制、代谢和免疫等诸多过程中发挥重要作用。一方面，自噬可降解有害或多余的细胞成分，减少这些成分对细胞的直接或间接损伤；另一方面，降解的物质转化为细胞代谢过程中所需的营养和能量，用于细胞重塑[3]。自噬在形态学上分为3种不同的形式：微自噬、分子伴侣介导的自噬、巨自噬。微自噬被定义为溶酶体膜动力学，直接包裹和运输细胞质成分到溶酶体或液泡进行降解的过程；分子伴侣介导的自噬被描述为溶酶体膜上特定可溶性蛋白质降解的选择性机制；巨自噬是双膜小泡包裹需要降解物质形成自噬小体，再与溶酶体融合后降解的过程。尽管这些自噬形式在过程上存在差异，但都具有维持细胞稳态的功效[4]。由于巨自噬是最具有自噬特征的一种形式，一般情况下若无特殊说明，自噬均指“巨自噬”，故本文重点介绍巨自噬的过程。

简单来说，自噬的形成过程包括[5]：细胞内待降解底物形成分隔膜；分隔膜延伸、拓展形成自噬前体；自噬前体包裹降解底物形成自噬泡，进而形成双层膜结构的自噬体；自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体；水解酶将自噬溶酶体中的底物分解成可能再利用的小分子物质。在饥饿或应激因素的作用下，并由多种自噬相关基因及信号蛋白的调控，引起自噬形成。自噬在各种疾病发展进程中的作用及参与调控自噬的因素受到学者们的关注。一般来说，可控范围内的自噬有利于维持细胞稳态，过度自噬或自噬不足均可引起细胞损伤，成为多种疾病的重要发生机制之一；靶向自噬并以恢复自噬通量正常化为目标，成为决策不同疾病治疗措施的重要依据之一。

2 雌激素抑制细胞过度自噬的作用

2.1 神经保护作用 对于神经细胞而言，自噬通常维持基本代谢，保护细胞免受能量代谢障碍、内质网应激、营养缺乏、炎性反应和各种病理状况的影响，但过度自噬是有害的。Yang等[6]应用双侧卵巢去势(ovariectomy，OVX)大鼠结扎双侧颈总动脉(bilateral common carotid arteries occlusion，BCCAO)建立雌激素缺乏血管性痴呆大鼠模型，发现正常大鼠海马CA1区锥体神经细胞形态正常，排列整齐，细胞核圆而饱满，核仁和细胞质清晰，双层核膜清晰，染色质排列均匀，细胞质中有正常数量形态典型的细胞器；雌激素缺乏大鼠海马区神经细胞排列松散、紊乱，数量明显减少，多为梭形或多边形，形态不规则，超微结构显示细胞核变形，核仁缩小，核膜溶解，核染色质聚集成块，细胞器数量显著减少，线粒体肿胀和空泡化，粗面内质网扩张和破裂；雌激素治疗后，细胞核和细胞器的超微结构损伤明显减轻，且E2早期治疗比后期治疗效果更显著。进一步研究显示，雌激素缺乏大鼠海马体自噬相关蛋白LC3B、Beclin1表达显著增加，E2早期治疗后显著降低。Lin等[7]在不同的脊髓损伤大鼠模型中发现，E2处理显著减少了大鼠脊髓坏死和缺损面积，脊髓中运动神经元显著保留，减少了自主神经功能障碍，改善了运动功能，同时显著降低了神经元LC3Ⅱ和Beclin-1的mRNA与蛋白表达。Yue等[8]的研究发现，谷氨酸显著降低了神经细胞活力，上调了自噬相关蛋白Beclin1和LC3Ⅱ/Ⅰ、下调了P62表达；GPER激动剂G1预处理可增强神经细胞活力，降低Beclin1和LC3Ⅱ/Ⅰ、增强P62表达，且G1的保护作用被GPER抑制剂G15阻断；G1通过磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)—蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)—哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)途径抑制神经细胞自噬。此外，在大鼠模型上发现，细胞过度自噬参与了脊髓缺血再灌注损伤的发生过程，抑制过度自噬可减轻这一损伤[9]，但雌激素是否能通过抑制过度自噬发挥作用还需要研究。

上述研究表明，雌激素可以有效减轻血管性痴呆及脊髓损伤导致的神经细胞损伤，这种作用是通过抑制过度自噬实现的，且GPER激活可抑制谷氨酸诱导的过度自噬从而发挥神经保护作用。但雌激素抑制自噬发挥有益作用是否与ERα、ERβ有关，还需要研究。

2.2 心肌保护作用 过度自噬参与了多种心脏疾病的发生发展，包括心脏肥大、心力衰竭和缺血再灌注损伤。女性绝经前心血管疾病的发病率较低，与雌激素水平相关。雌激素调节心肌细胞自噬的作用受到关注。Wang等[10]的研究显示，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)处理增加了心肌细胞的乳酸脱氢酶活性，降低了细胞活力，上调了Atg5和Beclin1的mRNA表达，增加了LC3-Ⅱ表达，E2治疗逆转了LPS的上述不良作用。结果表明，LPS引起心肌损伤与功能障碍的作用与诱导细胞自噬、降低细胞活力有关，E2保护心肌细胞的作用是通过逆转LPS引起心肌细胞过度自噬实现的。

Bcl2/腺病毒E1B 19kDa蛋白相互作用蛋白3(Bcl2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3，BNIP3)作为一种缺氧诱导的标志物，可诱导自噬和凋亡，心肌BNIP3高表达与心肌肥厚、心肌病的发生相关。Chen等[11]的研究发现，BNIP3过表达引起了心肌H9c2细胞的自噬和凋亡，E2通过下调BNIP3、自噬相关蛋白LC3Ⅱ、凋亡蛋白Caspase3表达，从而阻断了BNIP3诱导的自噬和凋亡，减少了H9c2细胞死亡。多西环素或E2处理，增强了BNIP3与ERα结合，削弱了BNIP3与Bcl-2、Rheb和泛素结合，从而减轻了细胞损伤，说明ERα与Bcl-2或Rheb竞争结合BNIP3，从而允许Rheb激活mTOR，导致自噬抑制。

E2或ERβ处理均显著抑制了缺氧引起H9c2细胞的自噬与凋亡、BNIP3高表达，促进胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R)、p-Akt磷酸化和Bcl-2表达，降低了缺氧相关蛋白、自噬相关蛋白和线粒体凋亡相关蛋白的积累，提高了缺氧条件下Bak蛋白水平；ERβ拮抗剂可完全消除ERβ的心脏保护特性；瞬时转染Tet-On ERβ基因，增加了缺氧处理H9c2细胞的ERβ表达，ERβ通过抑制缺氧诱导因子-1α调节的BNIP3和胰岛素样生长因子结合蛋白-3信号通路抑制缺氧诱导的心肌细胞自噬和凋亡[12]。

研究显示[13]，心肌细胞表达GPER，G1可减弱血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)诱导的心肌细胞肥大，并下调心钠素(atrial natriuretic factor，ANF)和脑钠肽的基因表达水平；G1处理抑制了AngⅡ增加心肌细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的作用，提高了p-Akt、p-70S6K1和p-mTOR的蛋白水平，降低了p-4EBP1的表达；G1抑制心肌细胞自噬的作用被GPER拮抗剂G15、Akt抑制剂MK2206、自噬激动剂雷帕霉素(rapamycin，RAPA)抑制。结果表明，GPER激活通过上调PI3K-Akt-mTOR信号通路和抑制自噬来减轻AngⅡ诱导的心肌细胞肥大，从而发挥心肌保护作用。生物信息学分析表明，Fam120b、RGD1562310、Ctrb1、Rap1gap和Pag1这5种蛋白可能是参与G1抑制AngⅡ诱导心肌细胞肥大的关键蛋白，但这5种蛋白与心肌细胞自噬的作用有待进一步观察。

上述研究表明，雌激素治疗能够减轻多种因素引起的心肌细胞自噬，减轻心肌细胞死亡进而发挥心肌保护作用，该作用与心肌细胞的3种ERs有关；单纯激动心肌细胞ERs，亦发挥同样的心肌保护作用。

3 雌激素诱导细胞自噬的作用

3.1 神经保护作用 阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种与老龄化高度相关的神经退行性疾病，β-淀粉样蛋白(amyloid protein β，Aβ)聚集是AD显著的病理特征，广泛用于AD神经病理学的诊断[14]。由于体内分泌的雌激素通过其受体发挥提高记忆力、改善认知能力的功能，故AD主要发病女性人群为绝经后的妇女[15]。大量研究表明，自噬增强可促进Aβ降解，从而保护AD患者的神经功能[16]。雌激素通过其受体调节自噬具有减少Aβ聚集、促进Aβ降解的作用，进而抑制AD的发展进程[17]。Wei等[18]采用人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系研究发现，ERβ过表达有助于增加LC3-Ⅱ表达，提高自噬通量；ERβ转染增加了LC3阳性表达的亚细胞结构自噬体和自溶体，且敲除ERβ降低了LC3-Ⅱ表达；ERβ选择性激动剂DPN(diarylpropionitrile)显著增加了SH-SY5Y细胞LC3-Ⅱ的水平；ERβ过表达增加了SH-SY5Y细胞ATG7表达和ATG5-ATG12复合物的形成，而ERβ沉默具有相反的效果，且依赖于ATG7表达；这些证据表明，ERβ通过激活ATG7蛋白诱导了SH-SY5Y细胞自噬，且ERβ与SH-SY5Y细胞的自噬状态呈正相关。雌激素通过其受体激活自噬促进Aβ降解，从而发挥神经保护作用，使雌激素可能成为治疗AD的备选新药物。

此外，G1对大脑中动脉闭塞小鼠模型的星形胶质细胞具有明显的保护作用，且这种作用在GPER-/-小鼠中消失；谷氨酸通过激活体外培养的原代星形胶质细胞mTOR和c-Jun N端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、抑制p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路，诱导星形胶质细胞增殖，降低星形胶质细胞自噬，G1处理通过调节p38 MAPK通路而不是mTOR和JNK信号通路使自噬恢复到基础水平，从而达到保护星形胶质细胞的作用[19]。结果表明，活化GPER增加自噬有利于保护星形胶质细胞。

3.2 心肌保护作用 在D-半乳糖(D-galactose)引起心肌老化的小鼠模型上，E2治疗显著提高了小鼠心肌功能，降低了心肌老化标志物的蛋白水平，提高了Beclin1、LC3、ATG5的mRNA与蛋白表达，降低了Beclin1、LC3、ATG5的甲基化水平；E2的作用被ERα特异性抑制剂甲基哌啶吡唑(methyl-piperidino-pyrazole，MPP)抑制；结果表明，E2通过ERα下调了自噬相关基因的甲基化、增加自噬进而发挥抗心肌老化的作用[20]。在OVX大鼠内毒素血症模型上，E2替代治疗提高了内毒素血症OVX大鼠的存活率，抑制了LPS引起心肌核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)p65、诱生型一氧化氮合酶高表达与氧化应激、炎性反应，提高了心肌自噬标志蛋白(Atg12、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ)表达及血红素加氧酶-1和热休克蛋白70表达，结果表明，E2通过增加心肌细胞自噬可对抗LPS的心肌损伤[21]。

3.3 肝细胞保护作用 脓毒症和脓毒症性休克是急危重症医学面临的重要临床问题。王云等[22]的研究发现，盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)后，雄性大鼠血清丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶显著高于雌性大鼠，肝细胞损伤程度、嗜中性粒细胞浸润程度均强于雌性大鼠，自噬蛋白表达增加但低于雌性大鼠，雌激素处理显著降低了2个转氨酶水平及肝细胞损伤程度，且低于雌性大鼠，且自噬蛋白表达明显高于CLP的雄性和雌性大鼠；同样的实验结果亦应用雄性小鼠进行了验证。这一结果表明，雌激素通过诱导细胞自噬减轻脓毒症后的肝损伤。此外，具有植物雌激素作用的葛根素(puerarin，PU)可减轻重金属镉污染对小鼠肝细胞AML-12的细胞毒性，该作用与抑制细胞凋亡、氧化应激和恢复细胞自噬活性有关[23]。

3.4 骨保护作用 研究表明，雌激素可以通过诱导细胞自噬发挥抗细胞凋亡作用。流行病学证据表明，类风湿性关节炎的病因和发病机制与雌激素代谢和缺乏密切相关，ERs广泛分布于滑膜、骨和软骨细胞[24]。酸敏感离子通道1α(acid sensing ion channels 1α，ASIC1α)是一种钠离子渗透通道，通过诱导软骨细胞凋亡损伤软骨细胞，亦可通过增加类风湿性关节炎患者软骨细胞凋亡和滑膜炎性反应从而参与酸诱导的软骨和骨损伤[25-26]。抑制或缺乏ASIC1α可保护关节免受酸诱导的损伤，细胞自噬参与了这一过程，因此靶向ASIC1α可能在类风湿关节炎治疗中发挥作用[27-29]。Song等[24]的研究发现，E2通过ERα以时间依赖的方式降低了软骨细胞ASIC1α蛋白表达；且更为显著地降低了蛋白合成抑制剂环己酰亚胺(10 μm)处理6 h后软骨细胞ASIC1α蛋白水平，表明E2通过降解ASIC1α以达到降低ASIC1α蛋白水平的作用；E2增加了Beclin-1和LC3-Ⅱ的表达，减轻了酸处理的软骨细胞凋亡，表明E2的抗凋亡作用是通过上调自噬标志蛋白表达进而诱导自噬实现的；自噬抑制剂CQ预处理抑制了E2降低ASIC1α表达的作用，进而阻断了E2抗软骨细胞凋亡、减轻关节软骨损伤的有利作用。这一数据表明，雌激素可通过降低ASIC1α表达、激活自噬，进而抑制ASIC1α诱导的软骨细胞凋亡，减轻关节软骨损伤，雌激素成为治疗类风湿关节炎新的药物，这为类风湿性关节炎的治疗开辟新的道路。

4 雌激素减轻急性肺损伤的作用

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是重症患者最早发生的器官损伤之一，也是引起患者高病死率的一个主要原因。近年来的研究显示，雌激素及其受体可减轻多种原因导致的ALI，其机制涉及抑制氧化应激、炎性反应、细胞凋亡、细胞焦亡、改善内皮屏障功能等多个方面[30-33]。细胞自噬在ALI的发病过程中具有双刃剑作用，自噬过度或不足均参与了ALI的发生，自噬通量正常化成为防治ALI的关键靶点，以调节自噬通量正常化的一些治疗措施在减轻ALI的过程中发挥重要作用[34]。此外，靶向巨噬细胞自噬，有利于减轻LPS诱导脓毒症后的炎性反应[35]，提示减轻自噬可能成为通过抗炎机制减轻脓毒症ALI的新措施。但雌激素抗ALI的作用是否与调节自噬有关，还有待进一步证实。

5 小结与展望

雌激素对细胞自噬的双向调节作用参与了多种疾病发展进程中的细胞保护作用，从而可能成为自噬相关疾病防治的有效药物之一。雌激素对自噬发挥的双向调节作用主要是通过不同的ERs实现的，且与PI3K-AKT-mTOR、NF-κB、MAPK等多种信号通路有关。在重症医学研究领域，细胞自噬参与了多种致病因素引起组织器官损伤的病理过程，雌激素治疗也对组织器官损伤具有很好的干预作用，但相关机制仍未完全阐明。因此，深入研究雌激素调节自噬进而发挥细胞保护作用与机制，将助力器官损伤的临床决策，也有利于拓展雌激素的药理学作用，为以雌激素作为新型药物、在多种疾病中发挥有利干预作用提供实验依据。同时，还需要将雌激素药理学作用的基础研究成果转化应用于临床，也将为疾病开辟新的治疗思路。此外，应结合临床资料，关注雌激素对于自噬相关疾病的治疗效果，以期扩展雌激素的临床应用范围。但在临床上如何寻找反映自噬通量的生物标志物仍是目前的难题。