利用CRISPR/Cas9技术构建ACE2基因修饰的猪胎儿成纤维细胞系

张成霖，方斌，刘晓蕊，李琳，王盈，杨海元，戴一凡

南京医科大学江苏省异种移植重点实验室，江苏 南京 211166

自2019 年12 月以来，新型冠状病毒即严重急性呼吸综合征冠状病毒2 型（severe acute respirato⁃ry syndrome coronavirus type 2，SARS⁃CoV⁃2）已经蔓延到多个国家和地区，引发了严重的全球公共卫生安全问题［1-2］。SARS⁃CoV⁃2 是一种新型β冠状病毒［3］，具有高度传染性、较高隐蔽性和广泛组织趋向性等特征。SARS⁃CoV⁃2 为单股正链RNA 病毒，基因组约为29.9 kb，主要由2个侧翼非翻译区和整段可编码蛋白的开放阅读框（open reading frame，ORF）组成［4］。SARS⁃CoV⁃2 编码的S 蛋白是介导病毒入侵宿主细胞的关键蛋白，由S1 和S2 两个亚基组成。S1 亚基上的受体结合域能与靶细胞上的受体特异性结合，从而决定病毒对细胞的趋向性和致病性［5］。

已有研究表明血管紧张素转换酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）是SARS⁃CoV⁃2的主要功能受体［6］，ACE2 的表达是SARS⁃CoV⁃2 感染靶器官的关键。不同物种的ACE2与SARS⁃CoV⁃2的S蛋白亲和力表现出差异性，决定了相应物种对SARS⁃CoV⁃2 病毒易感性的不同。如鸡、大鼠、兔等对SARS⁃CoV⁃2病毒不易感，而人、水貂、猫等对SARS⁃CoV⁃2 病毒易感。猪作为重要的农业品种之一，与人类关系密切，存在着作为中间宿主间接向人类传播SARS⁃CoV⁃2 的风险［7］。因此，通过改造猪的ACE2 来构建SARS⁃CoV⁃2 不易感猪模型有重要现实意义。ACE2 是由X 染色体基因编码的锌⁃金属肽酶，属于Ⅰ型跨膜糖蛋白，含有N 端信号肽、C 端结构域和胞外催化结构域［8］。ACE2 除了作为SARS⁃CoV⁃2 主要的功能受体，本身还行使促进血管紧张素成熟、调控血管收缩和血压等重要生理功能［9］。因此，构建SARS⁃CoV⁃2 不易感的猪不能通过直接敲除猪的ACE2 基因来实现，而应采取策略将猪内源ACE2 替换为与S 蛋白低亲和力的ACE2。

本研究通过对多个物种的ACE2蛋白序列进行生物信息学分析，构建了与SARS⁃CoV⁃2 低亲和力的嵌合ACE2基因片段。然后，利用CRISRP/Cas9基因编辑技术将该ACE2 整合到猪的ACE2 基因位点，同时实现猪内源ACE2 基因敲除和嵌合ACE2基因敲入，构建了ACE2 基因修饰的猪胎儿成纤维细胞（porcine fetal fibroblast，PFF）系，为进一步利用体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer，SCNT）技术构建SARS⁃CoV⁃2 不易感的猪模型奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验细胞

培养27 d的长白猪PFF细胞为本实验室留存的细胞。

1.1.2 主要试剂与仪器

pX330质粒（Addgene公司，美国）；DH5α感受态细胞、质粒抽提试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；BbsⅠ限制性内切酶、T4DNA连接酶和T7E1酶（New England Biolabs 公司，美国）；Basic Nucleofec⁃torTMKits 转染试剂盒（Lonza 公司，德国）；DMEM 培养液、G418药物、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、青链霉素双抗和DPBS 缓冲液（赛默飞世尔科技公司，美国）。单孔细胞核转染仪（Lonza 公司，德国）；生物安全柜（赛默飞世尔科技公司，美国）。引物序列和磷酸化的寡核苷酸序列（南京金斯瑞公司）。

1.2 方法

1.2.1 ACE2嵌合基因的设计

利用DNAstar软件中的Protean模块分析猪和大鼠ACE2蛋白的二级结构，使用Chou Fasman算法预测猪和大鼠ACE2 蛋白α螺旋、β折叠、β转角的比例。使用Swiss Model 在线（https：//www.swissmodel.ex pasy.org/）对猪和大鼠ACE2蛋白进行三维建模，然后利用Pymol软件比较两者三维结构的相似度，得出均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）值。

在NCBI 数据库中下载大鼠和鸡的ACE2 氨基酸序列，在DNAMAN 中进行氨基酸序列比对，根据氨基酸序列的比对结果在大鼠ACE2氨基酸序列的基础上，将与SARS⁃CoV⁃2 结合的几个关键氨基酸残基替换为相应位点鸡ACE2 的氨基酸残基，并通过密码子优化获得ACE2 嵌合基因的基因序列，交由南京金斯瑞生物技术有限公司合成。

1.2.2 靶向猪ACE2的打靶载体构建

根据NCBI数据库中的ACE2基因序列，选取第10外显子设计1对扩增引物，上游引物ACE2_F：5′⁃CCAGTATGACATGGCTTATGCCAT⁃3′，下游引物ACE2_R：5′⁃CCCCAACTGCCTCATGGAAAC⁃3′，以长白猪PFF 细胞的基因组为模板进行PCR 扩增测序，确定是否与数据库中的ACE2 基因序列一致。使用在线工具CRISPOR（http：//crispor.tefor.net/）设计sgRNA，合成相应的2 条Oligo 片段：5′⁃GCATT⁃AGCTCCATTTCTGAGC⁃3′和5′⁃GCTCAGAAATG⁃GAGCTAATGC⁃3′。利用BbsⅠ酶切pX330 质粒，酶切产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳（100 V、60 min），切胶回收后纯化。用去离子水将sgRNA Oligo稀释至100 μmol/L。设置PCR 仪退火程序：37 ℃30 min，95 ℃5 min，再以5 ℃/min 的速度降至25 ℃。将线性化的pX330载体与退火产物用T4DNA连接酶进行连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，涂板挑取单菌落测序鉴定正确的重组子，获得pX330_ACE2载体。

1.2.3T7E1酶切实验

将转染ACE2打靶载体后的细胞转移到6 cm培养皿中培养，待细胞长满后，消化提取基因组。PCR扩增并回收目的片段。T7E1 酶切体系：纯化产物200 ng；10×NEB Buffer 2 2 μL；去离子水补至19 μL。在PCR 仪中进行退火：95 ℃5 min；-2 ℃/s 降至85 ℃；-0.1 ℃/s 降至25 ℃；4 ℃保存。体系中加入1 μLT7E1酶，37 ℃孵育90 min。之后每管加入4 μL的6×Loading buffer，1%琼脂糖凝胶电泳，1 h后分析结果。根据公式InDel（%）=100×［1-（1-裂解产物占比）1/2］，计算编辑效率。

1.2.4 ACE2嵌合基因敲入载体构建

在长白猪ACE2第10外显子上的敲除位点上下游各选取40 bp 序列作为同源的左臂（LA）和右臂（RA），中间加入连接肽（GSG Linker）以及2A 肽序列，在两同源臂外侧设计相同且反向的sf_sgRNA靶点序列（5′⁃GTGCTTCGATATCGATCGTTTGG⁃3′），合成得到pUC57_ARM⁃2A 载体。利用引物In⁃Fu⁃sion_F：5′⁃GAGAACCCTGGACCTATGTCAAGCTCC⁃TGCTGGC⁃3′，In⁃Fusion_R：5′⁃ATTAGCTCCATTT⁃CTCGCGCCGCACACAAA⁃3′，通过In⁃fusion 克隆将ACE2嵌合基因插入到经Esp3Ⅰ线性化pUC57_ARM⁃2A载体上，构建ACE2嵌合基因敲入的供体ACE2_KI。

合成2条Oligo片段（sf_sgRNA⁃F：5′⁃GTGCTTC⁃GATATCGATCGTT⁃3′和sf_sgRNA⁃R：5′⁃AACGATC⁃GATATCGAAGCAC⁃3′），退火后与线性化的pX330载体进行连接构建ACE2 嵌合基因敲入载体pX330_sf。

1.2.5 细胞转染与单克隆细胞的筛选与鉴定

将生长27 d 的原代长白公猪PFF 细胞复苏在6 cm培养皿中，细胞量约为2.6×106个。使用含16%FBS的全培养基（42 mL DMEM 培养液、8 mL FBS和500 μL 青链霉素双抗），在38.5 ℃、5%CO2的条件下培养约24 h，至细胞融合度＞90%。用0.05%胰酶消化约2 min，1 200 r/min 离心收集细胞。将ACE2嵌合基因敲入载体ACE2_KI和两个打靶载体pX330_ACE2、pX330_sf以及抗性质粒pHY54_SV40⁃neo按照Lonza核转染试剂盒说明书建议比例配置，并进行细胞转染，程序为U⁃023。转染结束后，将细胞分盘至10 cm 培养皿中，细胞培养24 h后，用1 mg/mL的G418筛选9～12 d，挑单细胞克隆于24孔板中，待细胞长满后，消化至12 孔板中培养。留部分细胞在24 孔板中继续培养，长满后消化并用NP40裂解细胞，提取细胞基因组DNA［10-11］。使用在线工具Cas⁃OFFinder（http：//www.rgenome.net/cas⁃of⁃finder/）寻找潜在的脱靶位点并设计引物。对基因组DNA进行PCR测序鉴定，将基因型鉴定正确且未发生脱靶效应的细胞克隆进行冻存。

2 结果

2.1 猪/大鼠ACE2结构的比较

对猪和SARS⁃CoV⁃2 不易感动物大鼠的ACE2结构进行比较［12］，利用DNAstar 软件中的Protean 模块分析猪和大鼠ACE2 的二级结构，并使用Chou⁃Fasman算法预测猪和大鼠ACE2的α螺旋、β折叠、β转角的比例。猪ACE2 的α螺旋占41.2%，β折叠占24.7%，β转角占27.8%（图1A）；大鼠ACE2 的α螺旋占40.4%，β折叠占27.5%，β转角占28.8%（图1B），显示猪和大鼠ACE2 蛋白具有高度相似的二级结构。使用Swiss Model在线工具对猪和大鼠ACE2进行三维建模，接着利用Pymol软件比较两者三维结构的相似度，得出RMSD值为0.052，表明两者在三维结构上亦具有极高的相似性（图1C），因此可以推测猪和大鼠ACE2在相应组织或器官内应具有相似的生理功能，使用大鼠ACE2替换猪ACE2具有可行性。

图1 猪/大鼠ACE2蛋白质二级结构和三级结构分析Figure 1 Analysis of secondary and three⁃dimensional structures of ACE2 protein between pigs and rats

2.2 ACE2嵌合基因的合成及猪/嵌合ACE2结构的比较

随着病毒在人群和自然界中的不断复制，新的变异也随之出现，新变异株的产生可能会增加大鼠感染SARS⁃CoV⁃2 的风险。因此，本研究在大鼠ACE2 的基础上构建大鼠/鸡ACE2 嵌合基因作为敲入基因。首先，根据大鼠和鸡的ACE2 的氨基酸序列比对结果（图2A），将ACE2 与S 蛋白结合的关键氨基酸位点（第19、31、34、35、42、353、354位氨基酸残基）替换为鸡的氨基酸残基。

对嵌合ACE2进行三维建模，并与猪ACE2的三维结构进行比对（图2B），得出RMSD 值为0.054，表明改造后的嵌合ACE2 结构并未发生较大变化，与猪的ACE2 仍具有极高的相似性，可以使用该嵌合的ACE2来替换猪的ACE2。

图2 嵌合ACE2氨基酸序列的比对（A）和三级结构的分析（B）Figure 2 Comparison of chimeric ACE2 amino acid sequences（A）and analysis of tertiary structures（B）

2.3 载体的构建及靶位点编辑效率检测

依据测序确认的长白猪ACE2 第10 外显子序列，利用在线工具设计sgRNA（图3A）。利用BbsⅠ酶将pX330载体线性化（图3B），并与sgRNA退火形成的双链连接，最后将连接产物进行转化，挑取单菌落并送测序，测序结果表明pX330 载体上成功插入了猪ACE 基因靶点的sgRNA 序列。以转染打靶载体pX330_ACE2后的细胞基因组为模板进行PCR扩增，将PCR 产物退火，再经过T7E1 酶切，琼脂糖凝胶电泳结果显示目的片段被切成两段（图3C）。公式计算得出编辑效率为12.02%。

利用Esp3Ⅰ酶线性化pUC57_ARM⁃2A载体，同时根据设计的In⁃Fusion 引物扩增ACE2 嵌合基因，通过无缝克隆技术将ACE2嵌合基因插入敲入载体中，构建ACE2 嵌合基因敲入载体（图3D），使用In⁃Fusion 引物对敲入载体进行测序验证，测序结果显示ACE2嵌合基因敲入载体ACE2_KI构建成功。此外将两臂外侧的sgRNA 与线性化的pX330 载体连接，将连接产物进行测序验证，测序结果表明打靶载体pX330_sf构建成功（图3E）。

图3 载体的构建和剪切效率验证Figure 3 Construction of the vector and verification of shearing efficiency

2.4 长白猪PFF细胞系ACE2基因靶向编辑过程

将ACE2嵌合基因敲入载体ACE2 KI_pUC57和两个打靶载体pX330_ACE2、pX330_sf 以及抗性质粒pHY54 SV40⁃neo转染长白猪PFF细胞后，Cas9蛋白会在sf_sgRNA 和ACE2_sgRNA 的引导下分别对ACE2 嵌合基因敲入载体ACE2 KI_pUC57（图4）和猪的ACE2 基因第10 外显子进行剪切，通过同源定向修复机制将含有同源臂的线性ACE2嵌合基因整合到猪ACE2基因内部，从而导致猪的ACE2基因被破坏，而嵌合ACE2 基因在P2A 短肽自我剪切作用下，可以获得完整的嵌合ACE2蛋白。

图4 嵌合ACE2基因的敲入编辑策略Figure 4 Schematic of chimeric ACE2 knock⁃in strategy

2.5 ACE2编辑的细胞克隆鉴定

经G418 筛选后共获得19 个单细胞克隆，测序结果显示有4 个单细胞克隆的ACE2 基因成功被ACE2 嵌合基因所替换（表1，图5A），敲入效率达21%。对在线工具Cas⁃OFFinder寻找到的10个潜在脱靶位点进行测序验证，测序结果显示所有潜在位点并未发生脱靶效应（图5B）。

图5 嵌合ACE2敲入的细胞克隆测序分析Figure 5 Sequencing of chimeric ACE2 knock⁃in cell colonies

表1 嵌合ACE2敲入的长白猪PFF的基因型Table 1 Gene type of chimeric ACE2 knock⁃in cell colonies of PFF

3 讨论

CRISPR/Cas9基因编辑技术在猪遗传修饰研究中的应用，极大推动了抗病猪品种的培育［13-14］。如猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respi⁃ratory syndrome，PRRS）又称“蓝耳病”，是造成全世界养猪产业经济损失最严重的猪传染病之一，该病的病原是猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproduc⁃tivc and respiratory syndrome virus，PRRSV）。经研究发现CD163蛋白是PRRSV 感染宿主的必需受体［15］，2014年，Whitworth等［16］成功制备了CD163双等位基因敲除猪，该基因编辑猪在进行攻毒试验后未表现出蓝耳病的临床症状。该研究表明病毒受体基因编辑后能显著提高猪的抗病能力。因此，对猪进行基因编辑以降低其对SARS⁃CoV⁃2的易感性是一种可行策略。

ACE2 是SARS⁃CoV⁃2 的主要功能受体，ACE2还参与调节血压、体液平衡和细胞增殖等过程，具有重要的生理功能。ACE2基因缺失会引起动物的生理功能异常甚至死亡［17］。目前尚未出现SARS⁃CoV⁃2 感染大鼠的报道，但随着病毒在人群和自然界中的不断复制，产生的新变异毒株存在感染大鼠的风险。但SARS⁃CoV⁃2 作为一种β属冠状病毒能够感染包括人类、家畜在内的哺乳动物，却无法感染鸟类。因此，本研究采取了一种新的策略来进行猪ACE2 基因的改造。在SARS⁃CoV⁃2 不易感的大鼠ACE2 基因的基础上，将与S 蛋白RBD 区域直接接触的关键氨基酸序列进一步替换为β冠状病毒不易感的鸡ACE2 序列［18］，构建大鼠/鸡嵌合ACE2 基因，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将嵌合ACE2基因整合到猪ACE2基因的第10号外显子上。利用猪内源的ACE2 基因启动子和2A 肽序列来表达嵌合的ACE2基因，同时实现了猪内源ACE2基因的敲除和嵌合ACE2基因的敲入。

本研究利用短同源臂（40 bp）来构建ACE2基因敲入供体，转染后获得19 个抗性的猪PFF 细胞克隆，其中4 个为阳性单细胞克隆（即嵌合的ACE2 基因整合到猪内源的ACE2位点），基因敲入效率高达21%。以上结果显示，短同源臂的供体简化了载体构建过程，而且不会降低基因敲入效率。

由于ACE2 基因在猪的PFF 细胞中不表达，本研究没有对ACE2 编辑的PFF 细胞克隆进行ACE2的表达检测和功能验证。本研究设计的嵌合ACE2 是否能在猪体内发挥正常的生理功能和降低猪对SARS⁃CoV⁃2 的易感性，还需要通过体细胞核移植获得ACE2 编辑的克隆猪后，开展实验来进行研究探讨。

综上，本研究首次在猪PFF细胞中利用CRISPR/Cas9 技术实现了外源ACE2 基因的定点整合，成功建立了ACE2 基因编辑的长白猪PFF 细胞系，为SARS⁃CoV⁃2 不易感猪模型的构建提供了重要的实验材料。